Shimadzu HPLC Blog: Pufr - Část druhá

V minulých dílech Shimadzu HPLC Blogu jsme probrali tato témata:

• Díl 01: Začínáme
• Díl 02: Základní teorie
• Díl 03: Separační módy
• Díl 04: Chromatografie na reverzních fázích
• Díl 05: Izokratická vs. Gradientová eluce
• Díl 06: Anatomie HPLC instrumentace
• Díl 07: Detektory
• Díl 08: LCMS detektor
• Díl 09: Rovnice rozlišení
• Díl 10: Účinnost kolony
• Díl 11: Retenční faktor (k)
• Díl 12: Selektivita (α)
• Díl 13: Pufr - Část první

Výběr správného pufru a pH pro mobilní fázi je jedna věc, ale při práci s pufrovanou mobilní fází v HPLC nebo UHPLC analýze je třeba zohlednit a dbát ještě na několik dalších věcí. Pro zjednodušení jsme pro Vás připravili přehled nejdůležitějších bodů:

• Také v HPLC je kvalita výstupu určena kvalitou vstupu. Proto by všechna použitá rozpouštědla měla být alespoň v HPLC nebo MS kvalitě, aby nedošlo ke kontaminaci, která by mohla vést k falešným píkům nebo blokádám v systému. K přípravě vodných rozpouštědel, jako jsou pufrovací roztoky, by měla být vždy použita ultračistá voda.
• Speciální bezpečnostní uzávěry (obrázek 1) jsou dobrým řešením pro ochranu mobilní fáze před kontaminací a ztrátou rozpouštědla v důsledku odpařování. Uzavírají lahve a zároveň zajišťují bezpečný odtok HPLC rozpouštědel přes nasazené kapiláry. K zakrytí lahví s mobilní fází NESMÍ být použita fólie nebo parafilm, protože nezajišťují vzduchotěsné uzavření a mohou vést k extrakci látek, které se mohou do rozpouštědla vyluhovat.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 1: Správný (√) a nesprávný (x) způsob uzavření láhve s mobilní fází

• V ideálním případě by měly být pufry připraveny čerstvě v den použití. Ujistěte se, že roztok je čirý, homogenní a neobsahuje nerozpuštěné částice, v případě potřeby jej přefiltrujte přes filtr 0,45 µm. V případě, že jsou pufrovací roztoky skladovány, před použitím v systému se ujistěte, že jsou stále použitelné, protože mají omezenou životnost. 
• Většina pufrů poskytuje ideální podmínky pro růst mikroorganismů. Pufrovací roztok, který je delší dobu uchováván při pokojové teplotě, se zakalí, což signalizuje růst mikroorganismů. Tyto kontaminanty mohou způsobit řadu problémů, jako je ucpání systému, znečištění zpětných ventilů a chromatografické interference. Proto je třeba v praxi dodržovat některá preventivní opatření:

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 2: Preventivní opatření k zabránění růstu mikroorganismů v pufrech pro HPLC

• Je nutné zkontrolovat nastavené pH PŘED přidáním jakéhokoli organického rozpouštědla. Před měřením se ujistěte, že je pH metr přesně kalibrován. Ačkoli to není doporučeno, pokud se rozhodnete měřit pH v láhvi s mobilní fází, předem vyčistěte sondu, aby nedošlo ke kontaminaci.
• Těsnění a jiné smáčené části mohou být poškozeny vysokým obsahem solí a/nebo extrémními hodnotami pH. Pro prodloužení životnosti pístu a těsnění je vhodné použít zadní proplach těsnění (obvykle 10–20 % v/v IPA ve vodě) k odstranění všech potenciálně škodlivých zbytků mobilní fáze.
• Rozpustnost pufru je důležitým bodem, který je třeba zohlednit, a závisí na typu pufru, koncentraci, pH a typu použitého organického rozpouštědla. V ideálním případě by sůl měla být zcela rozpustná ve vodě a je třeba dbát na to, aby během gradientové analýzy nedošlo k vysrážení, když se vodný roztok smíchá s organickým rozpouštědlem. Nejlepší je směs předem otestovat, aby se zajistilo, že zůstane v roztoku, protože nerozpustné krystaly se mohou hromadit a způsobit ucpání přístroje. Před experimentem lze provést jednoduchý test smícháním různých částí pufru a organického rozpouštědla ve zkumavce, jak je znázorněno na obrázku 3. Pokud se směs zakalí, sůl není rozpustná v tomto složení mobilní fáze.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 3: Test rozpustnosti pufru ve směsi mobilní fáze

• Při použití pufru pH, kyseliny nebo zásady pouze v mobilní fázi A, se v gradientové analýze iontová síla mobilní fáze snižuje s rostoucím množstvím organického rozpouštědla (mobilní fáze B). Přidání stejné koncentrace pufru, kyseliny nebo zásady také do organického rozpouštědla (mobilní fáze B) může tomuto jevu zabránit a minimalizovat problémy se sklonem základní linie, gradienty pH a iontové síly a zlepšit linearitu pro nabité sloučeniny, jak je znázorněno na obrázku 4.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 4: Vliv proměnné iontové síly na základní linii v gradientové analýze bazických sloučenin

Mnoho problémů, které se vyskytují během HPLC nebo UHPLC analýzy, lze připsat kvalitě mobilní fáze nebo ucpání kapilár v důsledku částic zavlečených při dodávce rozpouštědla. Proto je vhodné věnovat pozornost správným postupům při výběru a přípravě rozpouštědel, aby se předešlo trvalým problémům v pozdější fázi. V některém z dalších příspěvků se budeme věnovat radám pro řešení problémů a vysvětlíme si, jak postupovat, pokud se tyto problémy přesto vyskytnou. V příštím článku se však blíže podíváme na stacionární fázi.

Edukativní HPLC a LC/MS webinaře Shimadzu

• Introducing Shimadzu's Analytical Intelligence in AQbD Method Development
• Chromatography Unleashed: Elevate Your Chiral and Achiral Separations
• Shimadzu's LC Method Development (RP) Series - Session 1: Method Screening
• MALDI-Imaging For All: A Researcher’s Guide
• Analytical Technologies for COVID-19 Challenges: Drug Repurposing | Vaccine Research | PPE & Material Testing | Environmental Monitoring

Výběr literatury Shimadzu se zaměřením na základy a principy HPLC a LC/MS v knihovně LabRulezLCMS

• Back to Basics - Explaining Resolution (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Gradient Retention Factor, K* (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Dispersion - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• RF-20A Fluorescence Detector Basics and Applications (Technické články | 2010)
• Back to Basics - Gradient Anatomy - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• The Very Basics of IMAGEREVEAL MS - With differential analysis as an example (Prezentace) 
• Back to Basics - Pump Linearity and Dwell Volume Measurements - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• Improving the Yield of Basic Amino Acids in a Protein Sequencer (Aplikace | 2023)
• SFC Basic Guide - Shimadzu Supercritical Fluid Chromatograph (Příručky | 2021)
• Rewriting the Book on Supercritical Fluid Chromatography (Technické články | 2024)