Shimadzu HPLC Blog: Rovnice rozlišení

V minulých dílech Shimadzu HPLC Blogu jsme probrali tato témata:

• Díl 01: Začínáme
• Díl 02: Základní teorie
• Díl 03: Separační módy
• Díl 04: Chromatografie na reverzních fázích
• Díl 05: Izokratická vs. Gradientová eluce
• Díl 06: Anatomie HPLC instrumentace
• Díl 07: Detektory
• Díl 08: LCMS detektor

Cílem každé chromatografické separace je adekvátní rozlišení analytů, které nás zajímají, v přiměřeném čase. Vývoj metody směřuje k dosažení tohoto cíle, a právě zde přichází ke slovu rovnice rozlišení. Je znázorněna na titulním obrázku a vyjadřuje závislost rozlišení (Rs) na účinnosti (N), selektivitě (α) a retenci (k). Zjednodušeně nám tedy může ukázat, jak může mít změna provozních parametrů chromatografie dramatický vliv na výkonnost metody. Teď vidíte, proč pochopení a zapamatování si této rovnice je docela důležité, chcete-li vyvinout chromatografickou separační metodu.

Začněme oblíbeným slovníčkem pojmů:

• Rozlišení (Rs): Měřítko separace dvou píků v chromatogramu - na základě rozdílů v retenci a šířce píku.
• Účinnost (N): Vyjadřuje se v „teoretických patrech“ (N) a udává, kolik píků může - teoreticky - kolona v daném chromatografickém systému oddělit. Čím užší jsou píky, tím větší je N. 
• Selektivita (α): Ukazatel relativní retence dvou složek ve směsi, což znamená schopnost chromatografického systému rozlišit mezi nimi.
• Retence (k): Měřítko toho, jak dobře je analyt zadržován.

A právě zde se již nevyhneme pohledu na některé rovnice, abychom se dozvěděli o závislosti těchto parametrů na různých faktorech, které můžeme při vývoji nové HPLC metody ovlivnit. Uděláme to popořadě a začneme s rozlišením. Ve většině učebnic nebo dokumentů uvádějících požadavky na metody najdete, že „základní rozlišení“ odpovídá vypočtené hodnotě 1,5 - osobně si myslím, že to je málo, ale kdo jsem, abych se hádal s autoritami. Každopádně 1,5, 1,7 nebo 2 - jak se k tomuto číslu dostaneme? Ve skutečnosti existují různé způsoby výpočtu. Uvedeme pouze jeden, a to ten, který je uveden v Evropském lékopise (EP) (obrázek 1). Jen nezapomeňte, že existují různé způsoby, které mohou vést k mírně odlišným hodnotám - pokud tedy porovnáváte údaje, ujistěte se, že byly vypočteny stejným způsobem.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 1 - Rovnice a názorný postup výpočtu rozlišení podle Evropského lékopisu
Toto je matematické vyjádření definice rozlišení, které ukazuje, že souvisí s retenčním časem a šířkou píku. Hodnotu rozlišení lze tedy zvýšit zvětšením rozestupu mezi dvěma píky nebo zmenšením šířky píku, aby byly píky užší. A TO nás přivádí zpět k rovnici rozlišení, když vidíme, že „selektivita“ je jiný termín pro „rozestup mezi dvěma píky“ a „účinnost“ je měřítkem toho, jak ostré jsou eluční píky. Obojího však lze dosáhnout pouze tehdy, když jsou sloučeniny na koloně dostatečně zadrženy. Obrázek 2 ukazuje vliv zvyšujících se hodnot retence, selektivity a účinnosti na rozlišení.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 2 - Graf závislosti retence, selektivity a účinnosti na rozlišení
Jak je vidět z grafu, jakmile retence dosáhne hodnoty k > 2, křivka se zplošťuje a zvyšování retence nemá výrazný vliv na rozlišení. Poté má největší vliv na rozlišení selektivita, a proto by se měl vývoj metody zaměřit na změnu selektivity. Vliv zvýšení účinnosti kolony je méně výrazný a lze jej využít k optimalizaci metody nebo jejímu urychlení, ale nebude příliš užitečný pro dosažení separace překrývajících se píků na prvním místě. Obrázek 3 uvádí názornější příklad grafu na obrázku 2.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 3 - Vizuální příklad vlivu retence, selektivity a účinnosti na rozlišení
Příště si povíme více o účinnosti (N), jak ji vypočítat a jak ji zlepšit. 

Edukativní HPLC a LC/MS webinaře Shimadzu

• Introducing Shimadzu's Analytical Intelligence in AQbD Method Development
• Chromatography Unleashed: Elevate Your Chiral and Achiral Separations
• Shimadzu's LC Method Development (RP) Series - Session 1: Method Screening
• MALDI-Imaging For All: A Researcher’s Guide
• Analytical Technologies for COVID-19 Challenges: Drug Repurposing | Vaccine Research | PPE & Material Testing | Environmental Monitoring

Výběr literatury Shimadzu se zaměřením na základy a principy HPLC a LC/MS v knihovně LabRulezLCMS

• Back to Basics - Explaining Resolution (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Gradient Retention Factor, K* (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Dispersion - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• RF-20A Fluorescence Detector Basics and Applications (Technické články | 2010)
• Back to Basics - Gradient Anatomy - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• The Very Basics of IMAGEREVEAL MS - With differential analysis as an example (Prezentace) 
• Back to Basics - Pump Linearity and Dwell Volume Measurements - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• Improving the Yield of Basic Amino Acids in a Protein Sequencer (Aplikace | 2023)
• SFC Basic Guide - Shimadzu Supercritical Fluid Chromatograph (Příručky | 2021)
• Rewriting the Book on Supercritical Fluid Chromatography (Technické články | 2024)