Shimadzu HPLC Blog: LCMS detektor

V minulých dílech Shimadzu HPLC Blogu jsme probrali tato témata:

• Díl 01: Začínáme
• Díl 02: Základní teorie
• Díl 03: Separační módy
• Díl 04: Chromatografie na reverzních fázích
• Díl 05: Izokratická vs. Gradientová eluce
• Díl 06: Anatomie HPLC instrumentace
• Díl 07: Detektory

Jak jste se již dozvěděli z přechozích dílů Shimadzu HPLC Blogu, sloučeniny, které se separují pomocí LC, lze identifikovat pomocí různých LC detektorů, což je skvělé pro analyty, které lze skutečně chromatograficky rozlišit. 

Standardní detektory však často neposkytují dostatečnou citlivost pro stopovou analýzu a s rostoucími požadavky na analýzu stále většího počtu sloučenin v jedné analýze nebo ve složitých matricích může být získání základní linie separace náročné. Například při analýzách pro bezpečnost potravin je třeba sledovat nízké hladiny stovek pesticidů, což může vypadat asi takto: 

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 1 - Příklad LCMS chromatogramu pro screeningovou analýzu pesticidů.

A právě zde vstupuje na scénu LCMS. Poskytuje vysokou citlivost a má schopnost rozlišit i společně se vyskytující analyty, a to podle jejich hmotnosti, lépe řečeno podle poměru hmotnosti a náboje (m/z).

Hmotnostní spektrometry měří hmotnost molekul a atomů. Stanovení hmotnosti (m) se provádí separací iontů v elektrickém nebo magnetickém poli. Hmotnosti se obvykle uvádějí jako m/z, což znamená poměr hmotnosti a náboje (z). U molekul, které nesou jediný náboj, což je nejčastější případ, lze m/z snadno použít k určení molekulové hmotnosti.

Hmotnostní spektrometrie poskytuje vysoce selektivní a citlivou detekční metodu s flexibilitou, která pokrývá aplikace v různých oblastech, jako je chemie, farmacie, klinické, potravinářské a environmentální testování. Během vývoje LC metody je hmotnostní spektrometrie cenným nástrojem pro identifikaci koeluujících neznámých látek a pro sledování pohybu píků. 

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 2: Typické zapojení LC separačního systému přes LCMS rozhraní, za kterým následuje ionizační zdroj a hmotnostní analyzátor.

LCMS byla původně umožněna zavedením API, což je zkratka pro ionizaci za atmosférického tlaku. API nabízí odpařování LC eluentu a tvorbu plynných iontů, které lze následně zavést do MS. API tedy slouží jako rozhraní do LCMS i jako ionizační zdroj. Tvorba iontů je pro tento proces zásadní, protože všechny hmotnostně spektrometrické přístroje jsou založeny na separaci iontů ve vakuu.

Co je to však iont a jak probíhá tvorba iontů?

Ionty jsou kladně nebo záporně nabité částice, atomy nebo molekuly. Ionizace je tedy proces přenosu buď kladného, nebo záporného náboje. K tomuto přenosu náboje dochází v ionizačním zdroji MS.

V LCMS se setkáváme se dvěma hlavními ionizačními technikami, a to ESI (Electrospray Ionization, česky ionizace elektrosprejem) a APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, česky chemická ionizace za atmosferického tlaku). Nejčastěji používanou ionizační technikou v LCMS je ionizace elektrosprejem, kterou si zde stručně vysvětlíme. 

ESI je měkká ionizační metoda, která vede především ke tvorbě molekulových iontů, takže stanovení molekulové hmotnosti sloučenin je snadné. Vzorek je unášen mobilní fází z LC systému do velmi tenké kapiláry - ESI trubice. Na špičku této trubice se přivádí vysoké napětí (až +/- 5 kV), kde vysoké elektrické pole vytváří jemnou mlhu z vícenásobně nabitých kapiček se stejnou polaritou, jakou má vkládané napětí. Proces odpařování rozpouštědla podporuje rozprašovač a proud zahřátého plynu. Během odpařování se poměr povrchu k náboji stále zmenšuje. Když vzájemná odpudivá síla nábojů překročí povrchové napětí kapaliny, kapky „explodují“ na menší. Tento proces se opakuje, dokud se kapičky nestanou dostatečně malými, aby usnadnily přechod iontů analytu do plynné fáze.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 3 - Schéma procesů ionizace a desolvatace v pozitivním (+) režimu ESI.

Účinnost a citlivost ionizačního procesu ovlivňuje několik parametrů, proto je třeba věnovat zvláštní pozornost průtoku LC a mobilním fázím. Obecně lze při přechodu z LC na LCMS analýzu použít podmínky LC metody, pokud jsou mobilní fáze a modifikátory (např. kyselina mravenčí, octan amonný nebo mravenčan) těkavé. V případě netěkavých pufrů (např. fosfátového pufru) jsou nutné úpravy LC metody.

Jakmile jsou ionty vytvořeny, je třeba je přenést z iontového zdroje do hmotnostního analyzátoru. V prvním kroku ionty vstupují do kapiláry, která je branou mezi atmosférickým tlakem a vakuem. K přenosu a soustředění iontů do svazku se používá několik stupňů tzv. iontové optiky (obrázek 4), které zajišťují, aby do hmotnostního analyzátoru mohlo vstoupit co nejvíce iontů, zatímco neiontové částice plynu jsou odstraněny.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 4 - Schéma iontové optiky Shimadzu (např. iontový vodič).

V hmotnostním analyzátoru lze určit m/z iontů analytu a dále je zpracovávat v závislosti na typu hmotnostního spektrometru. Rozlišujeme řadu hmotnostních analyzátorů, např. magnetické sektorové přístroje, hmotnostní spektrometr s iontovou pastí, hmotnostní spektrometr s Fourierovou transformací, kvadrupólový hmotnostní spektrometr, hmotnostní spektrometr doby letu. Všechny mají odlišné dělení a principy činnosti, které vedou k rozdílům v citlivosti, rozlišení a způsobech měření. Vysvětlení všech z nich dalece přesahuje rámec tohoto blogu. Z hlediska ceny, citlivosti a snadné obsluhy jsou kvadrupólové hmotnostní analyzátory lepší; jiné analyzátory však nabízejí vyšší rozlišení, vysokou přesnost hmotnosti a možnost generovat kvalitativnější informace. Který hmotnostní analyzátor je nejvhodnější, nakonec závisí na analytické úloze. Zaměříme se na kvadrupólové MS, protože tyto systémy jsou nejvýznamnější a nejrozšířenější v kvantitativní rutinní analýze.

Jak název napovídá, kvadrupól se skládá ze čtyř paralelních tyčí. Ionty vstupují do středové osy kvadrupólu. Na kvadrupól se přivádí stejnosměrný proud (DC) a vysokofrekvenční střídavý proud (AC). Pro danou kombinaci stejnosměrného a střídavého proudu mohou projít a dosáhnout detektoru pouze ionty s určitým poměrem m/z. Ionty s jinými hodnotami m/z narážejí do kvadrupólu, vybíjejí se a nemohou dosáhnout detektoru.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 5 - Schéma fungování kvadrupólu MS

Kvadrupól nabízí dva režimy měření: Skenování a monitorování vybraných iontů (SIM). V režimu skenování se postupně skenuje určený rozsah hmotností pro každou hodnotu m/z, zatímco v režimu SIM se monitoruje pouze vybraná hodnota m/z, jak je znázorněno na obrázku 6. Režim SIM poskytuje vyšší citlivost, ale je "slepý" pro vše ostatní ve vzorku, zatímco režim skenování nabízí více informací.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 6 - Schéma režimu skenování (A) a režimu SIM (B) při použití kvadrupólu.

Závěrem je třeba říci, že je k dispozici mnoho systémů MS/MS, známých také jako tandemová nebo hybridní MS. Skládají se ze dvou sériově zapojených hmotnostních analyzátorů, mezi nimiž je kolizní nebo fragmentační cela. Ionty jsou separovány v prvním hmotnostním analyzátoru (MS1), vstupují do kolizní cely a procházejí fragmentací, což vede ke vzniku menších iontů, tzv. produktových iontů, které jsou separovány v druhém hmotnostním analyzátoru (MS2) a detekovány. Použití MS/MS poskytuje podrobné informace o hmotnosti a umožňuje snížit interference matrice a šum pozadí, což vede k vyšší selektivitě a citlivosti. Široce používanými kombinacemi jsou TQ (přístroje s trojitým kvadrupólem MS) nebo Q-TOF (přístroje s kvadrupólem a analyzátorem doby letu). V mnoha analytických laboratořích tvoří přístroje TQ základ kvantitativní analýzy.

Doufám, že se vám tento velmi stručný náhled do základů LCMS líbil. V příštím díle se můžete těšit na vysvětlení rovnice rozlišení, neboť rozlišení je velmi důležitým parametrem při vývoji metody.