Shimadzu HPLC Blog: Účinnost kolony

V minulých dílech Shimadzu HPLC Blogu jsme probrali tato témata:

• Díl 01: Začínáme
• Díl 02: Základní teorie
• Díl 03: Separační módy
• Díl 04: Chromatografie na reverzních fázích
• Díl 05: Izokratická vs. Gradientová eluce
• Díl 06: Anatomie HPLC instrumentace
• Díl 07: Detektory
• Díl 08: LCMS detektor
• Díl 09: Rovnice rozlišení

Každý, kdo někdy uvažoval o přechodu ze standardní aplikace HPLC na rychlejší metodu UHPLC, slyšel o tom, jak se tím zvýší účinnost analýzy. Ale jak se to dělá a co to vůbec znamená? 

V minulém blogu jsme si vysvětlili, že účinnost se vyjadřuje v „teoretických patrech“ (N) a udává, kolik píků může - teoreticky - kolona v daném chromatografickém systému oddělit. Čím užší jsou píky, tím větší je N. A jako každou teoretickou hodnotu lze i tento počet teoretických pater vypočítat. Budeme se tedy muset podívat na další rovnice, jak je znázorněno na obrázku 1. Zde se také dozvíte, jak vypočítat výšku teoretického patra kolony (H) (nebo-li výškový ekvivalent teoretického patra), která souvisí s N, ale zohledňuje také délku kolony (L). H je tedy mírou účinnosti kolony na jednotku délky, vyjádřenou v patrech/m.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 1 - Rovnice a názorný postup výpočtu počtu (N) a výšky (H) teoretických pater

Pro výpočet N existuje další rovnice využívající šířku píku v jeho základně, ale myslím, že jedna rovnice bohatě stačí k vysvětlení závislosti účinnosti (N) na retenci a šířce píku. Jak je vidět na příkladu na obrázku 2, N se zvýší, když se zmenší šířka píku pro píky se stejným retenčním časem. Jinými slovy, počet teoretických pater kolony popisuje schopnost kolony vytvářet úzké píky. Ačkoli tedy účinnost nezávisí pouze na koloně, je do značné míry ovlivněna některými parametry kolony.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 2: Srovnání dvou píků separovaných na koloně s (a) větším N a (b) menším N
Existují různé způsoby, jak zlepšit účinnost. Jedním z nich je použití delší kolony, protože N je úměrné délce kolony. Zvětšení délky kolony však také prodlužuje dobu analýzy a zvyšuje tlak. Když se podíváte na rovnici pro rozlišení v blogu z minulého měsíce, zjistíte, že RS je funkcí druhé odmocniny z N, což znamená, že k malému zlepšení rozlišení je zapotřebí poměrně velkého zvýšení N. Je tedy třeba najít kompromis mezi účinností pro zvýšení rozlišení, dobou analýzy a tlakovými omezeními kolony a LC přístroje.

Dalším účinným prostředkem ke zvýšení účinnosti je zmenšení velikosti částic v koloně, protože účinnost je nepřímo úměrná velikosti částic. Stejně jako při zvětšení délky kolony se však při použití menších částic zvýší protitlak. Při analýzách HPLC se často používají zcela porézní částice o velikosti 5 nebo 3 µm. Pro využití menších částic, jako jsou 1,8 a 2 μm, jsou zapotřebí přístroje, které nabízejí vyšší tlakovou odolnost než 400 barů standardního systému HPLC. Tyto tzv. systémy UHPLC vydrží systémové tlaky > 1000 barů, aby bylo možné používat malé částice i při zvýšených průtocích a umožnit tak vysokorychlostní analýzu.

Průtoková rychlost je dalším faktorem, který při optimalizaci může zvýšit účinnost separační metody. Každá kolona má optimální průtok, aby bylo dosaženo nejvyšší účinnosti. To souvisí s přenosem hmotnosti mobilní fáze v pásmu analytu, který se často zobrazuje ve van Deemterově grafu. Jakmile se rozhodnete ponořit do podivného a úžasného světa HPLC, dříve nebo později uslyšíte o van Deemterově rovnici a budete přemýšlet, co to znamená - proto si k ní právě teď něco řekneme. Van Deemterova rovnice (obrázek 3) vztahuje účinnost (zde vyjádřenou v H) k rychlosti mobilní fáze.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 3 - Van Deemterova rovnice a) A, B a C jsou jako konstanty, které jsou ovlivněny náplní kolony a lineární rychlostí mobilní fáze zobrazenou v bodě b)Obrázek 3 ukazuje van Deemterovu rovnici, kde H představuje výšku teoretického patra. Malé hodnoty H naznačují dobrou výkonnost kolony. A, B a C jsou konstanty ovlivněné velikostí, distribucí a rovnoměrností materiálu náplně a μ popisuje lineární rychlost mobilní fáze, která je řízena průtokem. Zvýšené hodnoty difúze a odporu při přenosu hmoty v důsledku nejednotnosti náplně vedou k rozšíření pásů a ovlivňují rozlišení. Z toho vyplývá, že kvalita náplně stacionární fáze do značné míry ovlivňuje účinnost separace. Obrázek 4 snad objasní, co to znamená.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 4a - Vizualizace vlivu stacionární fáze na difúzi píků

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 4b - Vizualizace vlivu stacionární fáze na difúzi píkůNejprve je důležité pochopit, co znamená úzký nebo široký pík. V ideálním světě by se všechny molekuly analytu eluovaly z kolony přesně ve stejnou dobu a vytvářely by na detektoru jednu tenkou čáru nebo pás. Takto však HPLC nefunguje. Na své cestě hadičkami systému a kolonou se pás píku rozšiřuje. To znamená, že ne všechny molekuly eluují ve stejnou dobu, čímž vzniká charakteristická křivka píku v chromatogramu. Čím blíže k sobě molekuly zůstávají, tím je pík ostřejší. Faktory, které přispívají k tomuto rozšíření píku, jsou popsány ve van Deemterově rovnici:

• A = vířivá difúze, souvisí s rovnoměrností náplně kolony a délkou cest přes kolonu, snižuje se při použití menších částic (dp).
• B = axiální difúze bude menší při vyšších průtocích. 
• C = odpor vůči přenosu hmoty se zvyšuje s větší velikostí částic a vyššími průtoky.

Optimální průtoková rychlost nebo lineární rychlost (µ) bude tedy taková, která vyvolá současně nejnižší člen B a C, což lze zjistit z van Deemterova grafu, jak je znázorněno na obrázku 5.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 5 - Van Deemterův graf znázorňující vliv A, B a C na H při různých µTo je pro dnešní den z Shimadzu HPLC Blogu všechno a příště se můžete těšit na popis dalšího významného parametru při vývoji metody, a to retenčního faktoru (k).

Edukativní HPLC a LC/MS webinaře Shimadzu

• Introducing Shimadzu's Analytical Intelligence in AQbD Method Development
• Chromatography Unleashed: Elevate Your Chiral and Achiral Separations
• Shimadzu's LC Method Development (RP) Series - Session 1: Method Screening
• MALDI-Imaging For All: A Researcher’s Guide
• Analytical Technologies for COVID-19 Challenges: Drug Repurposing | Vaccine Research | PPE & Material Testing | Environmental Monitoring

Výběr literatury Shimadzu se zaměřením na základy a principy HPLC a LC/MS v knihovně LabRulezLCMS

• Back to Basics - Explaining Resolution (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Gradient Retention Factor, K* (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Dispersion - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• RF-20A Fluorescence Detector Basics and Applications (Technické články | 2010)
• Back to Basics - Gradient Anatomy - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• The Very Basics of IMAGEREVEAL MS - With differential analysis as an example (Prezentace) 
• Back to Basics - Pump Linearity and Dwell Volume Measurements - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• Improving the Yield of Basic Amino Acids in a Protein Sequencer (Aplikace | 2023)
• SFC Basic Guide - Shimadzu Supercritical Fluid Chromatograph (Příručky | 2021)
• Rewriting the Book on Supercritical Fluid Chromatography (Technické články | 2024)