Shimadzu HPLC Blog: Pufr - Část první

V minulých dílech Shimadzu HPLC Blogu jsme probrali tato témata:

• Díl 01: Začínáme
• Díl 02: Základní teorie
• Díl 03: Separační módy
• Díl 04: Chromatografie na reverzních fázích
• Díl 05: Izokratická vs. Gradientová eluce
• Díl 06: Anatomie HPLC instrumentace
• Díl 07: Detektory
• Díl 08: LCMS detektor
• Díl 09: Rovnice rozlišení
• Díl 10: Účinnost kolony
• Díl 11: Retenční faktor (k)
• Díl 12: Selektivita (α)

Když jsme v předchozích dílech mluvili o mobilní fázi, několikrát bylo zmíněno slovíčko „pufr“. Dnes bychom si měli vysvětlit, co to znamená, proč je to nutné, a poskytnout Vám několik tipů pro správný výběr a přípravu pufrované mobilní fáze v HPLC. 

Začněme otázkou „Co je to pufr?“. V chemii je pufr roztok, který je schopen udržovat stabilní pH, i když je přidáno omezené množství kyseliny nebo zásady. Jak to funguje? Jelikož se skládá z roztoku slabé kyseliny nebo zásady a její konjugované zásady nebo kyseliny, reagují tyto látky s přidanými kyselými vodíkovými nebo zásaditými hydroxidovými ionty tak, že nemohou ovlivnit pH tak, jako by tomu bylo v nepufrovaném roztoku. Obrázek 1 ukazuje příklad fosfátového pufru.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 1 - Pufr sestávající z dihydrogenfosforečnanu (slabá kyselina) a hydrogenfosforečnanu (slabá zásada)

Při přidání silné zásady, například NaOH, ion dihydrogenfosforečnanu (H₂PO₄^-) přijímá zásadité hydroxidové ionty (OH^-) a vytváří vodu a ionty hydrogenfosforečnanu (HPO₄^2-), což je slabá zásada, která nezpůsobuje významnou změnu pH roztoku. Nebudeme zabíhat příliš do detailů, protože tato znalost vám zřídka pomůže dosáhnout lepších chromatografických výsledků, ale může vás odradit od čtení tohoto blogu o LC. Místo toho vám poskytneme cennou informaci – znát kapacitu pufru! 

Kapacita pufru je míra schopnosti pufru udržovat stabilní pH, tedy jeho schopnost přijímat H⁺ nebo OH^- a neutralizovat jejich vliv na pH roztoku. Kapacita pufru je nejvyšší při pH = pKa slabé kyselé složky. Proto je nejlepší používat pufr v rozmezí ±1 jednotky pH od jeho pKa, kde je nejúčinnější. Může poskytovat adekvátní pufrování ±2 jednotky pH od pKa, ale mimo toto rozmezí je to jen roztok bez pufrovací schopnosti. Jelikož to samo o sobě nemusí být příliš užitečné, podívejte se do tabulky 1, kde najdete běžné HPLC pufry pro různé rozsahy pH. Pouze při použití v těchto mezích může pufr plnit svou funkci a zajistit stabilní pH v mobilní fázi.

Shimadzu HPLC Blog: Tabulka 1 - Běžné HPLC pufry pro různé rozsahy pH

Je třeba zohlednit nejen druh pufru, ale také jeho množství. Potřebujete dostatečně vysokou koncentraci, abyste dosáhli reprodukovatelných výsledků (< 5 mM pufr nemusí fungovat podle očekávání), ale ne příliš vysokou, abyste neriskovali srážení pufru. Obecně platí, že koncentrace pufru by měla být ≥ 5 a ≤ 100 mM. Vysoké koncentrace pufrových solí mohou také ovlivnit pohyblivé části čerpadla, zpětné promytí těsnění může pomoci prodloužit životnost těsnění pístu.

V posledním článku na téma Selektivita jsme se zabývali vlivem pH mobilní fáze na retenci ionizovatelných sloučenin. Pro získání robustní chromatografické metody je proto zásadní udržovat pH mobilní fáze stabilní. Obecně se doporučuje zahájit vývoj metody s kyselou mobilní fází v rozmezí pH 2–3. K tomuto účelu se často používá kyselina mravenčí, jako pufrovanou variantu doporučuji mravenčan amonný, zejména pokud uvažujete o detekci MS. Při této hodnotě pH je zabráněno ionizaci většiny organických kyselin a silanolových skupin na koloně (k tématu zbytkových silanolových skupin se vrátíme jindy). Zatímco bazické analyty budou za těchto podmínek plně nabité, je obecně obtížné zabránit ionizaci bazických vzorků pro HPLC analýzu. Vzhledem k tomu, že pKa většiny bazických sloučenin je >7, dostatečně vysoké pH k potlačení ionizace by způsobilo poškození většiny tradičních HPLC kolon. Pokud je nutné pracovat při vysokém pH, vyberte separační kolonu, která je pro daný rozsah pH stabilní.

Pokud potlačení iontů při nízkém pH nepřináší přijatelné výsledky ani po úpravě poměru organického rozpouštědla v mobilní fázi, lze pH upravit tak, aby se dosáhlo požadované separace jemným doladěním retence iontových analytů.

V tomto bodě se zdá důležité zmínit, jak se připravuje pufrovaná mobilní fáze při definovaném pH – a pokud se o tomto tématu začnete bavit ve skupině chromatografistů, zjistíte, že to může vyvolat dlouhou diskusi, protože existují různé způsoby přípravy pufru a výsledné mobilní fáze. Nejdůležitější je postupovat konzistentně, pokud chcete dosáhnout reprodukovatelných výsledků. Přesný postup přípravy mobilní fáze by proto měl být vždy součástí standardního operačního postupu (SOP) nebo protokolu metody.

Pokyny k přípravě různých pufrovacích roztoků ve správných koncentracích a pH najdete na: Příprava pufrovacích roztoků

K dispozici jsou také některé vynikající online výpočetní nástroje, které pomáhají při přípravě pufrů, například ChemBuddy nebo kalkulačka pH pufrů profesora Roberta J. Beynona.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 2 - Screenshot online kalkulátoru ChemBuddy Buffer Maker

Pro dnešek je to vše, nicméně o přípravě pufrů a správném postupu při jejich používání v HPLC a UHPLC analýzách je ještě mnoho co říci, takže příště si uvedeme několik tipů a triků pro práci s pufrovanými mobilními fázemi.

Edukativní HPLC a LC/MS webinaře Shimadzu

• Introducing Shimadzu's Analytical Intelligence in AQbD Method Development
• Chromatography Unleashed: Elevate Your Chiral and Achiral Separations
• Shimadzu's LC Method Development (RP) Series - Session 1: Method Screening
• MALDI-Imaging For All: A Researcher’s Guide
• Analytical Technologies for COVID-19 Challenges: Drug Repurposing | Vaccine Research | PPE & Material Testing | Environmental Monitoring

Výběr literatury Shimadzu se zaměřením na základy a principy HPLC a LC/MS v knihovně LabRulezLCMS

• Back to Basics - Explaining Resolution (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Gradient Retention Factor, K* (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Dispersion - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• RF-20A Fluorescence Detector Basics and Applications (Technické články | 2010)
• Back to Basics - Gradient Anatomy - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• The Very Basics of IMAGEREVEAL MS - With differential analysis as an example (Prezentace) 
• Back to Basics - Pump Linearity and Dwell Volume Measurements - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• Improving the Yield of Basic Amino Acids in a Protein Sequencer (Aplikace | 2023)
• SFC Basic Guide - Shimadzu Supercritical Fluid Chromatograph (Příručky | 2021)
• Rewriting the Book on Supercritical Fluid Chromatography (Technické články | 2024)