Shimadzu HPLC Blog: Retenční faktor (k)

V minulých dílech Shimadzu HPLC Blogu jsme probrali tato témata:

• Díl 01: Začínáme
• Díl 02: Základní teorie
• Díl 03: Separační módy
• Díl 04: Chromatografie na reverzních fázích
• Díl 05: Izokratická vs. Gradientová eluce
• Díl 06: Anatomie HPLC instrumentace
• Díl 07: Detektory
• Díl 08: LCMS detektor
• Díl 09: Rovnice rozlišení
• Díl 10: Účinnost kolony 

Dnešní článek bude rozvíjet to, co jsme se naučili v díle 3 o separačních módech a díle 4, který pojednával o chromatografii na reverzních fázích. Při vývoji metody je prvním zásadním krokem dosažení adekvátních retenčních časů komponent vzorku při zvolené kombinaci kolony a mobilní fáze. Co to ale znamená - adekvátní retence? Abychom na to odpověděli, musíme se podívat na tzv. retenční faktor (k), což je míra, do jaké je sloučenina zadržována kolonou ve srovnání s nezadržovanou složkou. Každá sloučenina, která je nastříknuta do proudu mobilní fáze, musí projít až k detektoru, než se na chromatogramu zobrazí pík. Dokonce i vzorek, který nevykazuje žádnou afinitu ke stacionární fázi, nebude eluován v čase 0, ale až po době potřebné k uražení této vzdálenosti. Tato „mrtvá doba“ neboli t0 závisí na objemu kolony a průtoku mobilní fáze. Aby byla hodnota k srovnatelná a nezávislá na typu kolony a provozních podmínkách při izokratické analýze, vypočítá se s jejich zohledněním. To tedy znamená - více rovnic - ale také vizuální vysvětlení, jak je znázorněno na obrázku 1. U gradientových separací je to o něco složitější, to si vysvětlíme později.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 1 Rovnice a názorný postup výpočtu mrtvého objemu kolony, mrtvého času a retenčního faktoru pro standardní typy kolon

Pomocí tohoto postupu tedy můžete vypočítat objem vaší kolony a výsledný „mrtvý čas“, který pak umožňuje určit retenční faktor k libovolného píku sloučeniny. Při hodnotě k všech analytů mezi 2-10 je dostatečná retence, která nabízí dobré rozlišení, a je méně pravděpodobné, že píky budou ovlivněny matricovými efekty, které eluují v blízkosti prázdného prostoru kolony. Rovněž není přínosem hodnota k >  10, protože nad 10 se rozlišení příliš nezvýší, ale větší hodnoty budou znamenat nadměrné eluční časy, tedy delší dobu analýzy a větší spotřebu rozpouštědla, jakož i větší rozprostření pásů a snížení výšky píku.

V HPLC na reverzní fázi existují dva hlavní faktory ovlivňující retenci, a to interakce vzorku se stacionární fází a síla rozpouštědla v mobilní fázi. Nižší množství organického rozpouštědla vede ke zvýšení retence. Takzvané „pravidlo tří“, které říká, že 10% změna poměru vodného a organického rozpouštědla by měla změnit hodnoty k přibližně třikrát, umožňuje přibližně předpovědět vliv změn množství organického rozpouštědla v mobilní fázi. Tuto a další zkratky pro odhad chromatografických parametrů najdete v tomto užitečném (bezplatném!) článku, který napsal John Dolan a který byl zveřejněn v LCGC Supplements: „Moje oblíbené zkratky“.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 2: Jak souvisí retence s % změnami anorganického rozpouštědla v mobilní fázi

Jak je tedy vidět na obrázku 2, pokud byste vynesli graf log k v závislosti na % anorganického modifikátoru, získali byste lineární graf. Pokud byste to provedli pro několik sloučenin a výsledkem by byly paralelní grafy, znamenalo by to, že všechny dotyčné analyty vykazují stejný retenční mechanismus a nebudou koeluovat, ani když zvýšíte množství %B, abyste urychlili analýzu. Pokud se však výsledek protíná, znamená to, že změny v %B ovlivní nejen retenci, ale také selektivitu a mohou vést ke koeluci. Zde vám grafy mohou napovědět, jaký poměr vodného a organického roztoku by byl dobrou volbou s ohledem na rozlišení, ale také na pořadí eluce. 

Nyní přejdeme k druhému faktoru, který řídí retenci v HPLC, tedy ke stacionární fázi. Již zde byl zmíněn termín „retenční mechanismus“, který vysvětluje důvod, proč nebo jakým způsobem může analyt interagovat se stacionární fází. V tabulce 1 je uvedeno několik příkladů.

Shimadzu HPLC Blog: Tabulka 1 Typické stacionární fáze a související retenční mechanismus

S určitými zkušenostmi a znalostí typu a vlastností cílových analytů může chromatografista informovaně rozhodnout, kterou kolonu zvolit pro zahájení vývoje metody. Sloučeniny vzorku však nemusí být vždy známé nebo se ve směsi vyskytují různé sloučeniny, což ztěžuje posouzení, která kolona by nabízela nejlepší retenci (a selektivitu!) pro analyty, které jsou předmětem zájmu. V takovém případě je vhodné provést screening kolon: Zvolte sadu několika kolon s různými vlastnostmi a na všech začněte provádět seznam experimentů, abyste zjistili, která kolona se jeví jako nejslibnější. V ideálním případě byste také měli vybrat různé mobilní fáze, abyste vyhodnotili ideální výchozí podmínky pro optimalizaci metody. Nicméně - to bude tématem příštího článku, ve kterém se budeme bavit o selektivitě (α). 

Edukativní HPLC a LC/MS webinaře Shimadzu

• Introducing Shimadzu's Analytical Intelligence in AQbD Method Development
• Chromatography Unleashed: Elevate Your Chiral and Achiral Separations
• Shimadzu's LC Method Development (RP) Series - Session 1: Method Screening
• MALDI-Imaging For All: A Researcher’s Guide
• Analytical Technologies for COVID-19 Challenges: Drug Repurposing | Vaccine Research | PPE & Material Testing | Environmental Monitoring

Výběr literatury Shimadzu se zaměřením na základy a principy HPLC a LC/MS v knihovně LabRulezLCMS

• Back to Basics - Explaining Resolution (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Gradient Retention Factor, K* (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Dispersion - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• RF-20A Fluorescence Detector Basics and Applications (Technické články | 2010)
• Back to Basics - Gradient Anatomy - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• The Very Basics of IMAGEREVEAL MS - With differential analysis as an example (Prezentace) 
• Back to Basics - Pump Linearity and Dwell Volume Measurements - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• Improving the Yield of Basic Amino Acids in a Protein Sequencer (Aplikace | 2023)
• SFC Basic Guide - Shimadzu Supercritical Fluid Chromatograph (Příručky | 2021)
• Rewriting the Book on Supercritical Fluid Chromatography (Technické články | 2024)