Shimadzu HPLC Blog: Detektory

V minulých dílech Shimadzu HPLC Blogu jsme probrali tato témata:

• Díl 01: Začínáme
• Díl 02: Základní teorie
• Díl 03: Separační módy
• Díl 04: Chromatografie na reverzních fázích
• Díl 05: Izokratická vs. Gradientová eluce
• Díl 06: Anatomie HPLC instrumentace

V sedmém díle Shimadzu HPLC Blogu si povíme něco více o možnostech detekce v HPLC. Podrobněji se seznámíme s UV/VIS detekcí, která je ve spojení s HPLC nejčastěji používána.

Vedle čerpadla a separační kolony je detektor další nezbytnou součástí každého systému HPLC - bez něj není žádný signál. V ideálním případě tento signál poskytuje množství informací. Nejenže se dozvíme, že z kolony něco eluuje, ale pokud vše probíhá dobře a máme dobrou separaci, získáme také poznatky o tom, kolik analytů, které nás zajímají, se ve vzorku nachází a jaká je koncentrace každé jednotlivé sloučeniny (kvantitativní analýza). Některé detektory navíc poskytnou i doplňkové údaje k identifikaci píků (kvalitativní analýza), a to nejen podle retenčního času, ale také podle spektrálních nebo hmotnostních údajů.

V HPLC používáme celou řadu detektorů s různými výhodami, zdaleka nejběžnější jsou tzv. spektrofotometrické detektory. Když na sloučeninu dopadá světlo, ta absorbuje světlo určité vlnové délky. Vlnová délka absorbovaného světla nebo to, zda analyt vůbec světlo absorbuje, závisí na struktuře látky, musí obsahovat alespoň jeden chromofor (viz vysvětlení pojmů níže). Pro detekci absorbance se používá světlo v ultrafialové až viditelné oblasti. 

Kvantitativní analýza v HPLC s použitím spektrofotometrických detektorů je založena na Lambertově-Beerově zákonu. Zjednodušeně řečeno říká, že absorbance a koncentrace jsou lineárně závislé, což znamená, že pokud vynesete absorbance proti koncentraci, dostanete přímku, jak je znázorněno na obrázku 1. Vytvořením tzv. kalibrační křivky se standardy o známé koncentraci můžete vypočítat koncentrace kdekoli na křivce v rámci tohoto lineárního rozsahu. 

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 1 - Schéma UV detektoru a Lambertův-Beerův zákon

V ultrafialovém detektoru (UV) se jako zdroj ultrafialového světla (190 - 600 nm) používá deuteriová lampa (D2), zatímco UV/Vis detektor obsahuje také wolframovou lampu, která zahrnuje viditelný rozsah vlnových délek (> 400 nm). Světlo vyzařované lampou se rozdělí na světelný paprsek určité vlnové délky. Poté prochází průtokovou celou a vstupuje do fotodetektoru (fotodiody). Elektrický signál odpovídající intenzitě vyzařovaného světla se sníží, když celou projde sloučenina, která absorbuje světlo o dané vlnové délce (obrázek 1). Čím vyšší je koncentrace vzorku, tím vyšší je absorbance, tím vyšší je pík v chromatogramu. 

Obrázek 2 ukazuje schéma detektoru s fotodiodovým polem (PDA) nebo detektoru s diodovým polem (DAD). Světlo prochází průtokovou celou a poté je rozptýleno pomocí difrakční mřížky. Poté je přijímáno prvkem diodového pole, který monitoruje intenzitu světla při každé vlnové délce. 

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 2 - Schéma detektoru s fotodiodovým polem

Jako vícekanálový detektor umožňuje PDA přístup ke spektrálním datům pro několik vlnových délek současně, což umožňuje měření kontinuálního UV spektra, jehož výsledkem je chromatogram s více vlnovými délkami. Jak je patrné z obrázku 2, detektor poskytuje nejen chromatogram, který se vztahuje k času na ose X a absorbanci na ose Y, jak se získává pomocí UV detektoru, ale také trojrozměrná data zobrazující různé vlnové délky na ose Z. Mnoho sloučenin lze jednoznačně identifikovat pomocí jejich UV-spektra, což je důvod, proč je PDA detektor velmi oblíbený pro vývoj metod HPLC. Příklad aplikace naleznete zde.

UV a PDA detektory jsou nejběžnějšími HPLC detektory díky své spolehlivosti, snadnému použití a univerzální odezvě na sloučeniny s chromofory. Jsou také nedestruktivní, což znamená, že vzorek opouští detektor beze změny, což je zásadní v případě, že chcete jednotlivé sloučeniny shromáždit pro další zkoumání. Existují však i další možnosti, které jsou uvedeny v tabulce 1. 

Nejprve si však ujasněme několik pojmů:

• Spektrální data: Data naměřená pro určité vlnové délky elektromagnetického spektra. V analýze HPLC se spektrofotometrickou detekcí se jedná o chromatogramy měřené při různých vlnových délkách nebo o celé UV spektrum sloučeniny. Lze jej také použít k určení čistoty píku, která ovlivňuje chování absorbance sloučeniny.
• UV spektrum: Graf závislosti absorbance na vlnové délce pro určitou sloučeninu. Lze jej použít k identifikaci sloučeniny a také k určení optimální vlnové délky absorbance pro získání maximální citlivosti detektoru pro analyt, který vás zajímá.
• Chromofor: Část chemické struktury sloučeniny, která absorbuje UV nebo viditelné světlo. Vlastní elektrony, které mohou absorbovat energii, která je převede ze základního stavu (nejnižší stav) do excitovaného stavu (stav s vysokou energií).

Shimadzu HPLC Blog: Tabulka 1 - Možnosti detektorů HPLC (neúplný seznam)

Stručně si teď popíšeme funkce těchto typických LC detektorů:

• Fluorescenční detektor (RF): Elektrony ve fluorescenčních molekulách mohou být excitovány pomocí určité vlnové délky - excitační vlnové délky - a poté emitovat světlo o jiné vlnové délce (emisní vlnová délka). Intenzita tohoto emitovaného světla se sleduje za účelem kvantifikace koncentrace analytu. Viz také: Fluorescenční detekce
• Detektor indexu lomu (RID): RID měří jakoukoli změnu indexu lomu - což znamená difrakci světelného paprsku obsahem průtokové cely - ve srovnání s referenční kyvetou naplněnou pouze mobilní fází. Viz také: Detektor indexu lomu (RID)
• Vodivostní detektor (CDD): CDD detekuje elektrickou vodivost iontů. Na dvojici destiček se přivede napětí, a pokud jsou přítomny ionty, protéká proud. Pokud jsou v mobilní fázi při průchodu průtokovou komorou detektoru ionty, vzniká signál, který je úměrný koncentraci iontů.
• ELSD detektor: Detekuje světlo rozptýlené částicemi, které zůstaly po odpaření mobilní fáze.

Možná jste si všimli, že v seznamu detektorů není uveden hmotnostní spektrometr (MS), proč tomu tak je? No, především MS NENÍ pouhý LC detektor. A taky proto, že by si zasloužil samostatný článek. Ale o tom až příště!

Edukativní HPLC a LC/MS webinaře Shimadzu

• Introducing Shimadzu's Analytical Intelligence in AQbD Method Development
• Chromatography Unleashed: Elevate Your Chiral and Achiral Separations
• Shimadzu's LC Method Development (RP) Series - Session 1: Method Screening
• MALDI-Imaging For All: A Researcher’s Guide
• Analytical Technologies for COVID-19 Challenges: Drug Repurposing | Vaccine Research | PPE & Material Testing | Environmental Monitoring

Výběr literatury Shimadzu se zaměřením na základy a principy HPLC a LC/MS v knihovně LabRulezLCMS

• Back to Basics - Explaining Resolution (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Gradient Retention Factor, K* (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Dispersion - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• RF-20A Fluorescence Detector Basics and Applications (Technické články | 2010)
• Back to Basics - Gradient Anatomy - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• The Very Basics of IMAGEREVEAL MS - With differential analysis as an example (Prezentace) 
• Back to Basics - Pump Linearity and Dwell Volume Measurements - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• Improving the Yield of Basic Amino Acids in a Protein Sequencer (Aplikace | 2023)
• SFC Basic Guide - Shimadzu Supercritical Fluid Chromatograph (Příručky | 2021)
• Rewriting the Book on Supercritical Fluid Chromatography (Technické články | 2024)