Shimadzu HPLC Blog: Izokratická vs. Gradientová eluce

Vzhledem k tomu, že jsme stále na začátku podivného a úžasného světa HPLC, nelze tento úvod do gradientové eluce v žádném případě považovat za podrobné vysvětlení všeho, co je třeba o gradientech HPLC vědět. Snažíme se pouze podat přehled o základních pojmech v HPLC, abychom Vám poskytli přehled o různých aspektech HPLC. Všechny tyto pojmy budou podrobněji vysvětleny později, když budeme hovořit o vývoji metod, kde je rozhodnutí, zda provést izokratickou nebo gradientovou eluci, zásadní. 

V minulém díle jsme si u chromatografie na reverzních fázích vysvětlili, že různé kombinace vody a organického rozpouštědla v mobilní fázi budou mít různý vliv na separaci a eluční chování separovaných sloučenin - mají různou sílu rozpouštědla. Slabému rozpouštědlu trvá déle, než látku přenese přes kolonu, zatímco silné rozpouštědlo ji eluuje rychleji. Rozhodnutí o vhodných podmínkách rozpouštědla je důležitým krokem při vývoji metody. Existují různé způsoby, jak dosáhnout LC separace, které se liší způsobem dodávání mobilní fáze. Při izokratické eluci zůstává složení mobilní fáze stejné po celou dobu analýzy, zatímco při gradientové eluci se složení mobilní fáze v průběhu času mění, takže síla rozpouštědla se zvyšuje. Jedná se o způsob, jak eluovat řadu sloučenin s různou polaritou v přiměřeném časovém okně.

Vysvětlíme si to na příkladu - na obrázku 1 vidíte dva chromatogramy z izokratické separace stejného vzorku. V tomto případě je methanol silné rozpouštědlo a voda slabé. V kombinaci 6 dílů methanolu a 4 dílů vody jsou první čtyři sloučeniny dobře separovány s pěknými ostrými píky, zatímco dvě později eluující látky vytvářejí široké boule. Čekání na jejich eluci také znamená, že doba trvání této analýzy je poměrně dlouhá.

Shimadzu/Gesa Schad: Obrázek 1 - Izokratická separace RPLC při konstantním složení mobilní fáze a) methanol / voda 6:4 v/v a b) methanol / voda 8:2 v/v.

Při druhé separaci byl podíl silnějšího rozpouštědla - methanolu - zvýšen na 8 dílů a v mobilní fázi zůstaly pouze 2 díly vody. To způsobí, že dvě silně zadržované sloučeniny eluují dříve a poskytují vyšší, ostřejší píky, ale dříve eluované sloučeniny již nejsou řádně odděleny - všechny nyní eluují společně. Kombinace rozpouštědel byla příliš silná na to, aby pro ně zachovala dobrou retenci a separaci. Takže v tomto případě - ideální by byla kombinace prvního a druhého scénáře - což je to, co může gradientová eluce nabídnout.

Při gradientové eluci se složení mobilní fáze během analýzy mění. V tomto příkladu na obrázku 2 začíná analýza s 30 % methanolu - říkáme mu rozpouštědlo B - a %B se postupně zvyšuje až na 95 %, zatímco obsah vody - neboli rozpouštědla A - klesá ze 70 % na pouhých 5 %. Mobilní fáze protékající kolonou, která unáší vzorek, tedy v průběhu analýzy mění své složení z poměrně slabého na poměrně silné. Tato měnící se mobilní fáze dává čas brzy eluujícím sloučeninám, aby interagovaly s kolonou při nízkém % B, a vytlačuje silně zadržené analyty z kolony s vysokým % silného rozpouštědla.

Shimadzu/Gesa Schad: Obrázek 2 - Gradientová analýza od 30 % methanolu do 95 % methanolu v mobilní fázi.

To je realizováno pomocí programu pro časování gradientu v softwaru a může výrazně zkrátit dobu analýzy a zlepšit tvar píků, které se jinak eluují pozdě. Je však třeba si uvědomit, že při gradientové eluci se mobilní fáze na konci analýzy velmi liší od počátečních podmínek metody. Proto se před nástřikem dalšího vzorku musí složení rozpouštědla obrátit a nechat po určitou dobu běžet za výchozích podmínek - tomu se říká reekvilibrace kolony, aby se každý vzorek analyzoval se stejným složením mobilní fáze. S ohledem na tuto dobu reekvilibrace nemusí být gradientová analýza vždy rychlejší separační metodou.

V každém případě, aby bylo možné nastavit gradient, musí být systém HPLC schopen dodávat a míchat dvě rozpouštědla současně, což vyžaduje buď dvě samostatná čerpadla, nebo nízkotlaký gradientový ventil. Příště tedy budeme hovořit o konfiguracích systému HPLC.

Edukativní HPLC a LC/MS webinaře Shimadzu

• Introducing Shimadzu's Analytical Intelligence in AQbD Method Development
• Chromatography Unleashed: Elevate Your Chiral and Achiral Separations
• Shimadzu's LC Method Development (RP) Series - Session 1: Method Screening
• MALDI-Imaging For All: A Researcher’s Guide
• Analytical Technologies for COVID-19 Challenges: Drug Repurposing | Vaccine Research | PPE & Material Testing | Environmental Monitoring

Výběr literatury Shimadzu se zaměřením na základy a principy HPLC a LC/MS v knihovně LabRulezLCMS

• Back to Basics - Explaining Resolution (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Gradient Retention Factor, K* (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Dispersion - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• RF-20A Fluorescence Detector Basics and Applications (Technické články | 2010)
• Back to Basics - Gradient Anatomy - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• The Very Basics of IMAGEREVEAL MS - With differential analysis as an example (Prezentace) 
• Back to Basics - Pump Linearity and Dwell Volume Measurements - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• Improving the Yield of Basic Amino Acids in a Protein Sequencer (Aplikace | 2023)
• SFC Basic Guide - Shimadzu Supercritical Fluid Chromatograph (Příručky | 2021)
• Rewriting the Book on Supercritical Fluid Chromatography (Technické články | 2024)