Shimadzu HPLC Blog: Separační módy

Navážeme na minulý díl (Shimadzu HPLC Blog: Základní teorie) a probereme, jak dosáhnout retence cílových sloučenin ve stacionární fázi. Rozhodujícími parametry, které je třeba zvážit, jsou kombinace mobilní fáze a stacionární fáze. Sloučeniny, které se raději zdržují v mobilní fázi, budou kolonou postupovat rychleji než ty, které budou pravděpodobně silně interagovat se stacionární fází. Pouze sloučeniny, které vykazují určitou přitažlivost ke zvolené separační koloně, v ní budou zadrženy. 

Pro začátek je třeba mít představu o chemických vlastnostech daného vzorku a podle toho zvolit vhodný separační systém. Různá uspořádání LC systému jsou znázorněny v tabulce 1.

Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Separační módy - Tabulka 1 Základní separační módy v HPLC

V praxi se naprostá většina aplikací HPLC provádí v režimu reverzní fáze s použitím kolony C18 - což bude podrobněji vysvětleno v dalším článku - ale i ostatní jsou neméně důležité a neměly by zůstat nezmíněny. Pro lepší pochopení budou v následujícím textu vysvětleny některé pojmy podrobněji.

Chromatografie na Normální fázi

• Literatura Shimadzu zaměřená na HPLC v knihovně LabRulezLCMS

V režimu kapalinové chromatografie "na normální fázi" se používá polární stacionární fáze a mobilní fáze s nízkou polaritou pro separaci nízko až středně polárních sloučenin, které se snadno rozpouštějí v organických rozpouštědlech (tj. vzorků, které jsou nerozpustné ve vodných roztocích). Separace je založena na rozdílech v polaritě, zatímco pro analýzu sloučenin s malými rozdíly v hydrofobicitě je nevhodná. Typickými stacionárními fázemi používanými v LC na normální fázi jsou např. oxid křemičitý nebo fáze s malými polárními funkčními skupinami, jako jsou amino, diol nebo kyano vázané na povrch oxidu křemičitého. Mobilními fázemi jsou nepolární rozpouštědla, např. n-hexan nebo ethylacetát. Grafické znázornění retenčního chování v LC na normální fázi je znázorněno níže.

Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Separační módy - Obrázek 1 Retence analytu v chromatografii na normální fázi

• Polarita: Fyzikální vlastnost sloučeniny, která určuje stupeň interakce s mobilní a stacionární fází při separaci na normální a reverzní fázi HPLC.
• Polární sloučenina: nebo-li „hydrofilní“, což v překladu znamená „s afinitou k vodě“ nebo „milující vodu“. Zjednodušeně řečeno - polární sloučenina se rozpouští ve vodě a silně interaguje s polární stacionární fází.
• Nepolární sloučenina: nebo-li „hydrofobní“ je jinými slovy „odpuzující vodu“ nebo „nesnášející vodu“, jako například olej. Nepolární sloučeniny se ve vodě nerozpouštějí a přilnou k nepolárním stacionárním fázím.

Iontová chromatografie (IC)

• Literatura Shimadzu zaměřená na Iontovou chromatografii v knihovně LabRulezLCMS

Jinými slovy „iontově výměnná chromatografie“ (IEC) je určena ke stanovení látek nesoucích náboj, ať už anorganických nebo organických iontů. Příkladem mohou být peptidy, proteiny, organické kyseliny nebo protonované báze. Iontově výměnná stacionární fáze se skládá z iontových skupin, které jsou vázány na nosič, zatímco mobilní fází je obvykle vodný pufrový systém s upraveným pH. Retence je řízena pH a iontovou silou mobilní fáze. K separaci dochází prostřednictvím výměnných rovnováh mezi analyty v roztoku a ionty eluentu, které interagují s nabitým povrchem stacionární fáze. Obrázek 2 ukazuje schéma tohoto mechanismu pro aniontové (záporně nabité) sloučeniny. Vyšší koncentrace iontů v mobilní fázi má za následek rychlejší eluci rozpuštěného iontu prostřednictvím konkurence.

Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Separační módy - Obrázek 2 Retenční mechanismus v iontové chromatografii

• pH: míra kyselosti nebo zásaditosti vodného roztoku. Stupnice se pohybuje od 1 (kyselý) do 14 (zásaditý). Změny pH ovlivňují chromatografickou retenci.
• Pufr: Roztoky pufru - tedy vodné roztoky slabé kyseliny a její soli (např. kyselina mravenčí + mravenčanový iont) jsou běžně používané mobilní fáze, protože mohou odolávat změnám pH při přidání malého množství kyselin nebo zásad, což vede ke stabilním LC podmínkám.
• Iontová síla: Koncentrace iontů v roztoku, přičemž ion znamená kladně nebo záporně nabitý atom nebo molekulu.

Vylučovací chromatografie (SEC)

• Literatura Shimadzu zaměřená na GPC/SEC v knihovně LabRulezLCMS

SEC se používá pro vzorky, které obsahují vysokomolekulární sloučeniny a jejichž složky se výrazně liší molekulovou velikostí. Lze ji například použít k separaci proteinů s různou velikostí, přičemž jako mobilní fáze se používají vodné pufry s téměř neutrálním pH, aby se zachovala biologická aktivita proteinů. Další typickou aplikací je stanovení distribuce molekulových hmotností polymerů, kde se typicky jedná o tzv. gelovou permeační chromatografii (GPC) - zde se jako eluent používají organická rozpouštědla při zvýšené teplotě, aby se polymery rozpustily. Retence je určena především velikostí pórů stacionární fáze, nikoliv vlastnostmi mobilní fáze. Molekuly malých rozměrů vstupují hluboko do pórů, což způsobuje, že se po koloně pohybují mnohem pomaleji než molekuly větších rozměrů, které se do pórů nevejdou (nebo jen částečně). Výsledkem je pořadí eluce z kolony podle velikosti, přičemž velké sloučeniny  vycházejí z kolony jako první, zatímco malé molekuly jsou zadržovány déle. Vizualizace tohoto principu je na obrázku 3.

Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Separační módy - Obrázek 3 Princip separace ve vylučovací chromatografii

Vzhledem k tomu, že chromatografie na reverzní fázi se používá v naprosté většině aplikací HPLC, bude jí věnován další příspěvek na blogu.

Edukativní HPLC a LC/MS webinaře Shimadzu

• Introducing Shimadzu's Analytical Intelligence in AQbD Method Development
• Chromatography Unleashed: Elevate Your Chiral and Achiral Separations
• Shimadzu's LC Method Development (RP) Series - Session 1: Method Screening
• MALDI-Imaging For All: A Researcher’s Guide
• Analytical Technologies for COVID-19 Challenges: Drug Repurposing | Vaccine Research | PPE & Material Testing | Environmental Monitoring

Výběr literatury Shimadzu se zaměřením na základy a principy HPLC a LC/MS v knihovně LabRulezLCMS

• Back to Basics - Explaining Resolution (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Gradient Retention Factor, K* (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Dispersion - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• RF-20A Fluorescence Detector Basics and Applications (Technické články | 2010)
• Back to Basics - Gradient Anatomy - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• The Very Basics of IMAGEREVEAL MS - With differential analysis as an example (Prezentace) 
• Back to Basics - Pump Linearity and Dwell Volume Measurements - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• Improving the Yield of Basic Amino Acids in a Protein Sequencer (Aplikace | 2023)
• SFC Basic Guide - Shimadzu Supercritical Fluid Chromatograph (Příručky | 2021)
• Rewriting the Book on Supercritical Fluid Chromatography (Technické články | 2024)