Shimadzu HPLC Blog: Anatomie HPLC instrumentace

Jen pro rychlé shrnutí - již jsme zjistili, jak systém HPLC funguje. K toku mobilní fáze systémem se používá čerpadlo rozpouštědla s definovaným průtokem. Nástřikové zařízení zavádí kapalný vzorek do proudu mobilní fáze. Separace probíhá na stacionární fázi a poté detektor identifikuje sloučeniny jednu po druhé, jak vystupují z kolony. 

V minulých dílech Shimadzu HPLC Blogu jsme probrali tato témata:

• Díl 01: Začínáme
• Díl 02: Základní teorie
• Díl 03: Separační módy
• Díl 04: Chromatografie na reverzních fázích
• Díl 05: Izokratická vs. Gradientová eluce

S těmito základy, které jsme nabyli v minulých dílech, se dnes blíže podíváme na přístrojové vybavení. Systémy HPLC se vyrábějí v různých tvarech a velikostech a z pochopitelných důvodů budeme pro příkladové obrázky používat zařízení Shimadzu. Obecně však platí, že zatímco velikost, barva a pojmenování se mohou lišit, skutečná konfigurace se u různých výrobců příliš neliší. K dispozici jsou modulární a integrované systémy, přičemž jeden nabízí maximální flexibilitu a všestrannost, zatímco druhý je snadněji instalovatelný a ideální, pokud je požadováno naprosto stejné uspořádání v několika laboratořích. Nakonec, který přístroj si vybrat, je asi věcí osobních preferencí, nebo záleží na požadavku aplikace.

Kromě čerpadla rozpouštědla vyžaduje typický systém HPLC zařízení pro zavádění vzorku, a to buď autosampler, nebo manuální injektor, který se naplní injekční stříkačkou, termostat nebo pec pro udržení kolony v prostředí s řízenou teplotou a vhodný detektor, který rozpozná analyt eluující z kolony a vytvoří na chromatogramu signální pík. Některé systémy vyžadují také systémovou řídicí jednotku, která propojuje a řídí funkčnost jednotlivých modulů. Je třeba zvážit některé další součásti, jako je držák pro bezpečné uložení lahví s rozpouštědly nebo odplyňovač, který zabraňuje vnikání vzduchových bublin do průtokového potrubí. Nejdůležitější však je, aby systém odpovídal svému účelu. Pokud chcete provádět gradientovou chromatografii, izokratický systém vám nebude vyhovovat, ať se snažíte sebevíc. Totéž platí pro detektor - musí být schopen „vidět“ analyzované sloučeniny, což nemusí být vždy tak snadný úkol.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 1 Jednoduchý systém HPLC pro izokratické metody

Obrázek 1 ukazuje schéma standardního izokratického systému. Z jedné láhve lze čerpat pouze jednu mobilní fázi, takže pokud chcete, aby to byla směs vodných a organických rozpouštědel, musela by být předem namíchána v láhvi, nelze ji měnit během analýzy nebo bez výměny láhve - v systému je pouze jedno čerpadlo a jedna linka s rozpouštědly. Jedná se o nejjednodušší sestavu a lze ji použít pouze pro izokratickou analýzu. (Vysvětlení rozdílů mezi izokratickou a gradientovou elucí najdete v posledním článku blogu.)

Aby bylo možné provádět gradientovou eluci - což znamená měnit složení rozpouštědla během analýzy - je třeba, aby bylo současně čerpáno více rozpouštědel. To lze realizovat různými způsoby. Na obrázku 2 je znázorněn binární vysokotlaký gradientový eluční systém neboli binární systém HPGE, jak by ho mohl nazvat zkušený odborník na LC.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 2 Binární vysokotlaký gradientový eluční systém

Vyžaduje dvě čerpadla s rozpouštědly (binární = v gradientu jsou použita dvě rozpouštědla) a tato rozpouštědla jsou smíchána pod tlakem za čerpadlem ve směšovači rozpouštědel. Míchání probíhá za čerpadly, ve vysokotlaké části průtokového potrubí, což vede k vytvoření vysokotlakého gradientu - ergo vysokotlaký gradientní systém. Jakmile jsou rozpouštědla smíchána, vše probíhá stejně jako v izokratickém systému - nástřik, kolona, detektor.

Tím se liší od takzvaného kvartérního nízkotlakého gradientového systému - neboli systému LPGE, kde se rozpouštědla mísí společně před čerpadlem, v nízkotlakém prostředí, jak je vidět na obrázku 3.

Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 3 Kvartérní nízkotlaký gradientní systém

Systém LPGE vyžaduje pouze jedno čerpadlo a vestavěný nízkotlaký gradientový ventil, který může míchat a mísit až čtyři rozpouštědla, což umožňuje ternární nebo dokonce kvartérní gradient, tedy se třemi nebo až čtyřmi rozpouštědly. Pro lepší mísicí kapacitu může být zabudován další směšovač, ale různá rozpouštědla se setkávají ve ventilu, před čerpadlem. Jedná se o technologii zabudovanou do kompaktních LC systémů, protože jedno čerpadlo a ventil vyžadují málo místa, ale nabízejí univerzální možnosti složení rozpouštědel. 

Historicky byly tyto dávkovací ventily považovány za méně přesné než míchání průtoku rozpouštědel z různých čerpadel, jak se to dělá v binárním vysokotlakém gradientovém systému, ale v současné době je výkonnost LPGE i v systémech UHPLC velmi dobrá. Přesto je zpoždění gradientu (zapamatujte si tento termín!) v systému LPGE mnohem vyšší, a proto se pro dosažení nejvyššího výkonu, nejnižšího šumu základní linie a nejmenšího objemu systému - také jako LCMS front-end - obecně upřednostňuje konfigurace HPGE. 

A jak správně podotkl doktor Nazmul Alam, samozřejmě i izokratickou eluci lze vytvořit pomocí uspořádání přístroje HPGE nebo LPGE. To je užitečné zejména při vývoji metod, kdy lze vybírat z různých možností rozpouštědel a najít optimální separační podmínky. 

Příště si uděláme malou odbočku k možnostem detektorů se zaměřením na UV / PDA detekci, které jsou ve standardních HPLC aplikacích nejběžnější, a pak už se patrně vrhneme na vývoj metod. 

Edukativní HPLC a LC/MS webinaře Shimadzu

• Introducing Shimadzu's Analytical Intelligence in AQbD Method Development
• Chromatography Unleashed: Elevate Your Chiral and Achiral Separations
• Shimadzu's LC Method Development (RP) Series - Session 1: Method Screening
• MALDI-Imaging For All: A Researcher’s Guide
• Analytical Technologies for COVID-19 Challenges: Drug Repurposing | Vaccine Research | PPE & Material Testing | Environmental Monitoring

Výběr literatury Shimadzu se zaměřením na základy a principy HPLC a LC/MS v knihovně LabRulezLCMS

• Back to Basics - Explaining Resolution (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Gradient Retention Factor, K* (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Dispersion - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• RF-20A Fluorescence Detector Basics and Applications (Technické články | 2010)
• Back to Basics - Gradient Anatomy - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• The Very Basics of IMAGEREVEAL MS - With differential analysis as an example (Prezentace) 
• Back to Basics - Pump Linearity and Dwell Volume Measurements - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• Improving the Yield of Basic Amino Acids in a Protein Sequencer (Aplikace | 2023)
• SFC Basic Guide - Shimadzu Supercritical Fluid Chromatograph (Příručky | 2021)
• Rewriting the Book on Supercritical Fluid Chromatography (Technické články | 2024)