Shimadzu HPLC Blog: Chromatografie na reverzních fázích

Jak bylo zmíněno v minulém článku, chromatografie na reverzních fázích se používá v naprosté většině aplikací HPLC, a proto si ji vysvětlíme podrobněji. Také se podíváme na vývoj a optimalizaci metod využívající tento separační mód.

Chromatografie na Reverzních fázích

• Literatura Shimadzu zaměřená na HPLC v knihovně LabRulezLCMS

Chromatografie na reverzní fázi (zkráceně RP z angl. reversed phase) je přesným opakem chromatografie na normální fázi (NP, z angl. normal phase). Pro separaci hydrofobních sloučenin, tedy analytů, které mají nízkou až střední polaritu, se používá nepolární stacionární fáze s polárními mobilními fázemi. Separace probíhá podle rozdílů v hydrofobicitě, takže polární sloučeniny budou polární mobilní fází přenášeny kolonou rychleji než nepolární, které interagují s nepolární stacionární fází - polární sloučeniny tedy eluují dříve než nepolární analyty, jak ukazuje obrázek 1.

Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Chromatografie na reverzních fázích - Obrázek 1 Retence analytu v chromatografii na reverzní fázi

Není to však tak jednoduché, protože ve hře jsou i další interakce, které je třeba vzít v úvahu. Typické stacionární fáze v RP LC používají hydrofobní funkční skupiny, které jsou chemicky vázány na silikagel (obrázek 2).

Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Chromatografie na reverzních fázích - Obrázek 2 Schematické znázornění skupin C18 vázaných na částice oxidu křemičitého.

Nejoblíbenějšími navázanými fázemi jsou oktadecylsilanové (ODS) nebo C18 skupiny, ale za zmínku stojí i další, specializovanější kolony, jako jsou C8, fenyl, pentafluorofenyl (PFP) nebo zakotvené polární fáze. Každá z těchto odlišných fází však kromě hydrofobní retence vykazuje i další retenční mechanismy, jako jsou dipól-dipól, π-π, silanofilní, elektrostatická přitažlivost a odpudivost a vodíková vazba. Proto mohou vytvářet rozdílnou chromatografickou selektivitu - což je další termín, který bude vysvětlen později, až se dostaneme k vývoji metody a výběru kolony.

Důvody, proč se dává přednost RP LC před NP LC, jsou použití méně toxických mobilních fází a použitelnost pro analyty rozpustné ve vodě, je také reprodukovatelnější. Polární mobilní fází v RP LC je obvykle voda, často s obsahem pufru pro kontrolu pH, v kombinaci s alkoholem nebo méně polárním rozpouštědlem. Retenční čas nepolární sloučeniny se snižuje s klesající polaritou mobilní fáze, protože síla rozpouštědla se zvyšuje, a hydrofobní analyty mají proto k mobilní fázi větší afinitu. Směsi rozpouštědel se používají k dosažení cíle eluce všech sloučenin v co nejkratším čase při základním rozlišení jednotlivých píků. A právě zde to začíná být zajímavé - když vidíme, že tohoto cíle často nelze dosáhnout jedním pevným poměrem polárního a méně polárního rozpouštědla - přichází ke slovu gradientová chromatografie. Nejprve však další slovníček pojmů:

• Kolona C18: Tyto kolony se také označují jako oktadecylsilanové (ODS), kde je stacionární fáze tvořena lineárními alkylovými řetězci složenými z 18 atomů uhlíku navázaných na nosič oxidu křemičitého (obrázek 2).
• Silikagel: Nejběžnější základní materiál pro plnění LC kolon, používaný také jako polární stacionární fáze v NP LC. Silikagel nebo jen oxid křemičitý označuje porézní oxid křemičitý. Vzhledem ke svému mírně kyselému charakteru přispívá ke složitosti retenčních mechanismů v RP LC.
• Síla rozpouštědla (eluční síla): Čím silnější je rozpouštědlo, tím rychleji přenáší analyt přes kolonu. Obrázek 3 uvádí několik rozpouštědel obvykle používaných v RP LC v pořadí podle síly rozpouštědla.

Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Chromatografie na reverzních fázích: Obrázek 3 Typicky používaná rozpouštědla seřazená podle síly rozpouštědla

A nyní zpět ke gradientové eluci. Nejčastěji se vzorek skládá z několika sloučenin s velkými rozdíly v hydrofobicitě, takže některé - polárnější analyty - vykazují na koloně C18 jen malou retenci, zatímco jiné eluují pomalu, nebo vůbec. V takovém případě by bylo skvělé, kdyby bylo možné během analýzy zvýšit eluční sílu mobilní fáze. Což je možné díky gradientová eluci, jenž je běžnou praxí v RP LC a je proveditelná s moderním vybavením HPLC. A na to se podíváme v  dalším článku.

Edukativní HPLC a LC/MS webinaře Shimadzu

• Introducing Shimadzu's Analytical Intelligence in AQbD Method Development
• Chromatography Unleashed: Elevate Your Chiral and Achiral Separations
• Shimadzu's LC Method Development (RP) Series - Session 1: Method Screening
• MALDI-Imaging For All: A Researcher’s Guide
• Analytical Technologies for COVID-19 Challenges: Drug Repurposing | Vaccine Research | PPE & Material Testing | Environmental Monitoring

Výběr literatury Shimadzu se zaměřením na základy a principy HPLC a LC/MS v knihovně LabRulezLCMS

• Back to Basics - Explaining Resolution (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Gradient Retention Factor, K* (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Dispersion - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• RF-20A Fluorescence Detector Basics and Applications (Technické články | 2010)
• Back to Basics - Gradient Anatomy - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• The Very Basics of IMAGEREVEAL MS - With differential analysis as an example (Prezentace) 
• Back to Basics - Pump Linearity and Dwell Volume Measurements - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• Improving the Yield of Basic Amino Acids in a Protein Sequencer (Aplikace | 2023)
• SFC Basic Guide - Shimadzu Supercritical Fluid Chromatograph (Příručky | 2021)
• Rewriting the Book on Supercritical Fluid Chromatography (Technické články | 2024)