Shimadzu HPLC Blog: Základní teorie

Dnes si povíme něco o rozlišení (R). Přesná identifikace a kvantifikace jednotlivých sloučenin je možná pouze tehdy, když příslušné píky v chromatogramu vystupují z kolony s určitým odstupem. Tento prostor mezi píky se nazývá rozlišení. Cílem chromatografické separace je odpovídající rozlišení složek, které nás zajímají, v přiměřeném časovém rámci.

Rs lze vypočítat s přihlédnutím k rozdílům v retenci a šířce elučních píků. Čím větší je rozdíl v retenčním čase (tR) a čím menší je šířka píku, tím širší je rozlišení. Tenké píky budou obecně lépe rozlišeny od sousedních píků než široké pásy, jak je znázorněno na obrázku 1.

Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Základní teorie - Obrázek 1 Znázornění vlivu retence a šířky píku na rozlišení

Než však budeme pokračovat, je dobré seznámit se s několika základními pojmy, se kterými se budeme setkávat i později:

• Základní linie: Čára, která je vidět na chromatogramu, když není detekována žádná sloučenina - základní linie odráží nulový signál.
• Separace na základní linii: Graf se vrací k nule, dotýká se základní linie, než vystoupá k dalšímu maximu píku.
• Chromatogram: Vizuální výstup separačního systému - různé píky na chromatogramu odpovídají různým složkám separované směsi (obrázek 2).
• Eluce: proces migrace sloučeniny přes kolonu nesenou mobilní fází.
• Retenční čas (tR): Doba, za kterou určitý analyt projde systémem za stanovených podmínek. Nazývá se retenční, protože stacionární fáze sloučeninu zadržuje.
• Rozlišení (Rs): Měřítko separace dvou píků v chromatogramu - na základě rozdílů v retenci a šířce píku.

Existují různé způsoby výpočtu rozlišení - žádným z nich se zatím nebudeme zabývat. O způsobu dosažení rozlišení a vzorcích pro jeho výpočet budeme hovořit, až se dostaneme k vývoji a optimalizaci metody. Jedním ze základních požadavků na cestě k separaci je však to, aby sloučeniny, které nás zajímají, vykazovaly retenci na stacionární fázi. Pokud analyt neinteraguje se stacionární fází kolony, pak celý vzorek projde kolonou a všechny jeho složky dopadnou na detektor současně, tudíž nedojde k separaci. Prvním důležitým krokem je tedy nastavení systému, ve kterém se budou sloučeniny na koloně zadržovat. Existují různé mechanismy, které nabízejí retenci pro různé vzorky, které představíme jako další téma. Dnes se ještě jednou podíváme na chromatogram, protože je důležité pochopit vizuální výstup - výsledek naší LC separace.

Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Základní teorie - Obrázek 2 Ukázka HPLC chromatogramu

Chromatogram je dvourozměrný graf, kde osa Y představuje intenzitu signálu detektoru a osa X čas analýzy. Odezva detektoru se vztahuje ke koncentraci cílové sloučeniny v elučním píku.

tR - neboli retenční čas - označuje časový interval mezi nadávkováním vzorku a vrcholem jeho píku. Na druhé straně doba, kterou potřebuje nezadržená látka k cestě přes kolonu k detektoru, se nazývá mrtvý čas a vyjadřuje se jako t0. Pouze pokud je tR větší než t0, znamená to, že pík vykazuje známky interakce se stacionární fází. Pokud sloučeniny eluují při t0, je třeba separační systém upravit tak, aby se zvýšila retence. Obecně platí, že za stejných podmínek bude analyt vždy vykazovat stejný retenční čas, a proto lze tR použít k identifikaci píku.

Podívejme se na příklad (obrázek 3): Standardní roztok kofeinu je analyzován pomocí HPLC, výsledkem je jeden pík sloučeniny v čase pět minut. V následném experimentu je stejným způsobem analyzován zředěný vzorek čaje, jehož výsledkem je chromatogram s několika píky. Mezi těmito signály je jeden eluující v retenčním čase přibližně 5 min, stejném jako u standardu kofeinu. Tento pík lze považovat za kofein, identifikovaný na základě LC retence. Dále lze plochu pod křivkou píku použít k výpočtu koncentrace cílové sloučeniny.

Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Základní teorie - Obrázek 3 Srovnání chromatogramu standardu kofeinu a vzorku zředěného čaje s vyznačeným píkem kofeinu

V dalším díle našeho Shimadzu HPLC blogu se můžete těšit na příklady různých separačních režimů v HPLC.

Edukativní HPLC a LC/MS webinaře Shimadzu

• Introducing Shimadzu's Analytical Intelligence in AQbD Method Development
• Chromatography Unleashed: Elevate Your Chiral and Achiral Separations
• Shimadzu's LC Method Development (RP) Series - Session 1: Method Screening
• MALDI-Imaging For All: A Researcher’s Guide
• Analytical Technologies for COVID-19 Challenges: Drug Repurposing | Vaccine Research | PPE & Material Testing | Environmental Monitoring

Výběr literatury Shimadzu se zaměřením na základy a principy HPLC a LC/MS v knihovně LabRulezLCMS

• Back to Basics - Explaining Resolution (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Gradient Retention Factor, K* (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Dispersion - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• RF-20A Fluorescence Detector Basics and Applications (Technické články | 2010)
• Back to Basics - Gradient Anatomy - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• The Very Basics of IMAGEREVEAL MS - With differential analysis as an example (Prezentace) 
• Back to Basics - Pump Linearity and Dwell Volume Measurements - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• Improving the Yield of Basic Amino Acids in a Protein Sequencer (Aplikace | 2023)
• SFC Basic Guide - Shimadzu Supercritical Fluid Chromatograph (Příručky | 2021)
• Rewriting the Book on Supercritical Fluid Chromatography (Technické články | 2024)