Shimadzu HPLC Blog: Začínáme

Toto video jsme vytvořili jako úvod pro techniku HPLC. Má poskytnout první představu o tom, co je to „vysokoúčinná kapalinová chromatografie“ (HPLC) a jaké jsou její možné aplikace. HPLC je definována jako „laboratorní technika separace směsi, při níž kapalná mobilní fáze přenáší analyt přes kolonu držící stacionární fázi“. To - podle mě - nechává některé otázky otevřené, např. jaká směs, jaký analyt, co je mobilní fáze, kolona, stacionární fáze?

Na úvod se naučme několik základních pojmů:

• Analyt: Například jídlo a pití nebo jakýkoli druh léku - Směs jednotlivých složek, které je třeba oddělit a jednotlivě změřit.
• Kolona (neboli separační kolona) je klíčový spotřební materiál při chromatografických separacích. LC kolonu lze popsat jako trubku - většinou vyrobenou z nerezové oceli, která drží „stacionární fázi“ mezi dvěma kovovými fritami a koncovkami, které umožňují instalaci v systému HPLC.
• Mobilní fáze: Mobilní fáze v HPLC je kapalina, která přenáší analyt přes separační kolonu.
• Stacionární fáze: Chemická vazba na malé částice, které vyplňují tělo kolony. Stacionární fáze je místem, kde dochází k separaci na základě rozdílných tendencí sloučenin k interakci s ní, což vede k rozdílné rychlosti pohybu kolonou a způsobuje separaci látek.

Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Začínáme - Obrázek 1 Typické uspořádání HPLC instrumentace

Jakmile se analyt nesený mobilní fází oddělí v koloně se stacionární fází, vhodný detektor rozpozná analyt vystupující z kolony a vytvoří signálový pík v grafu zvaném chromatogram.

Typické schéma systému HPLC a jeho jednotlivých složek je vidět na obrázku 1, zatímco obrázek 2 znázorňuje proces separace na koloně naplněné stacionární fází.

Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Začínáme - Obrázek 2 Schematické znázornění separace dvou sloučenin pomocí kapalinové chromatografie

Jako příklad aplikace kapalinové chromatografie uveďme nápoje. Nápoje (např. voda, džus, nealkoholický nápoj, káva, pivo, víno) obsahují vodu, cukr, vitamíny, kofein, alkohol a další složky - žádoucí i nežádoucí. Ty nežádoucí se nazývají kontaminanty, které mohou být škodlivé.

Jednou z nejčastějších aplikací HPLC je zajištění kvality výrobků - tedy bezpečnosti spotřebitelů. Aby bylo možné určit přesné množství každé jednotlivé složky - ať už jde o vitamin, cukr nebo pesticid - je třeba je od sebe oddělit a po oddělení HPLC usnadňuje identifikaci a kvantifikaci každé jednotlivé složky, aby bylo zajištěno správné složení složek, nepřítomnost nežádoucí kontaminace a kvalita výrobku.

Chceme vědět, co v něm je, a v ideálním případě také, kolik toho je přítomno. Cílem je separace a termínem pro měření separace v chromatografii je rozlišení. Rozlišení je důležité a bude tématem dalšího článku. 

Edukativní HPLC a LC/MS webinaře Shimadzu

• Introducing Shimadzu's Analytical Intelligence in AQbD Method Development
• Chromatography Unleashed: Elevate Your Chiral and Achiral Separations
• Shimadzu's LC Method Development (RP) Series - Session 1: Method Screening
• MALDI-Imaging For All: A Researcher’s Guide
• Analytical Technologies for COVID-19 Challenges: Drug Repurposing | Vaccine Research | PPE & Material Testing | Environmental Monitoring

Výběr literatury Shimadzu se zaměřením na základy a principy HPLC a LC/MS v knihovně LabRulezLCMS

• Back to Basics - Explaining Resolution (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Gradient Retention Factor, K* (Technické články | 2020)
• Back to Basics - Dispersion - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• RF-20A Fluorescence Detector Basics and Applications (Technické články | 2010)
• Back to Basics - Gradient Anatomy - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• The Very Basics of IMAGEREVEAL MS - With differential analysis as an example (Prezentace) 
• Back to Basics - Pump Linearity and Dwell Volume Measurements - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)
• Improving the Yield of Basic Amino Acids in a Protein Sequencer (Aplikace | 2023)
• SFC Basic Guide - Shimadzu Supercritical Fluid Chromatograph (Příručky | 2021)
• Rewriting the Book on Supercritical Fluid Chromatography (Technické články | 2024)