Základy vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) - DETEKTORY

O základním stavebním prvku u kapalinových chromatografů a tedy chromatografické pumpě a gradientech které poskytuje, jsme Vám psali v předchozím příspěvku Základy vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) - PUMPY A GRADIENT.

Jak se pásy (komponenty) postupně eluují z kolony, tok je přenáší k jednomu nebo více detektorům, které dodávají napěťovou odezvu jako funkci času. Tomu se říká chromatogram. Identifikace složky vzorku značí čas píku, kdy se objeví v chromatogramu s ohledem na standard. Plocha píku představuje množství.

Shimadzu: Jednotlivé separované složky vs. chromatografický záznam

V dnešním příspěvku se podívámé na přehled základních chromatografických detektorů a tedy ve vetšině případu konce celého separačního procesu, který nám umožní různé typy látek kvalitativně a kvantitativně stanovit na různých koncetračních hladinách.

UV/Vis detektor

• Reaguje na chromoforické analyty v rozmezí 190 – 800 nm
• Kontinuální monitorování jedné nebo více vybraných vlnových délek
• Možnost analýzy většiny organických analytů
• Kompatibilní s elucí gradientem

Aplikace, postery, příručky a technické články pro UV/Vis detektor.

Detektor fotodiodového pole (PDA)

• Reaguje na chromoforické analyty v rozmezí 190 – 800 nm
• Kontinuální monitorování více vlnových délek i celého rozsahu najdnou
• Kompletní spektrální profily chromatografických píků
• Kompatibilní s elucí gradientem

Aplikace, postery, příručky a technické články pro PDA detektor.

Fluorescenční detektor (FLD)

• Analyzuje pouze analyty, které fluoreskují přirozeně a nebo je zle derivatizovat fluoreskujícím činidlem
• Vysoce citlivostní a selektivní detekce
• Kompatibilní s elucí gradientem

Aplikace, postery, příručky a technické články pro fluorescenční detektor.

Detektor indexu lomu (RID)

• Považován za univerzální detektor pro všechny analyty
• Nejméně citlivý detektor
• Nekompatibilní s elucí gradientem

Aplikace, postery, příručky a technické články pro detektor indexu lomu.

Detektor rozptylu světla (ELSD)

• Považován za téměř univerzální detektor reagující na chromoforické i nechromoforické analyty
• Dobrá citlivost
• Kompatibilní s elucí gradientem

Aplikace, postery, příručky a technické články pro ELSD detektor.

Hmotnostní spektrometrické detektory (MS)

• Nejvyšší specificita analýzy
• Poskytuje informace o dané hmotě pro identifikaci analytu a objasnění struktury
• Vysoce citlivy
• Kompatibilní s elucí gradientem

Aplikace, postery, příručky a technické články pro LC/MS detektory.

UV/Vis vs. PDA detektor pro (U)HPLC

Systémy kapalinové chromatografie obsahují detektory vybrané podle chemie cílových analyzovaných látek. Drtivá většina detektorů pro (U)HPLC jsou detektory absorbující světlo v ultrafialové (UV) a viditelné (Vis) oblasti spektra rozsahu vlnových délek 190 – 900 nanometrů (nm) a často se označují jako UV/Vis nebo UV-Vis.

Většina analýz organických analytů je v ultrafialové oblasti 190 – 350 nm. HPLC/UV obecně měří pouze několik uživatelem stanovených a volitelných vlnových délek. Sledované analyty přírodních látek se většinou analyzují při vlnových délkách 220 a 274 nm. Potvrzení konkrétního analytu je tedy založeno na jeho reteční době v chromatografii.

Fotodiodové pole, také známé jako detektor diodového pole, může měřit celý rozsah vlnových délek v reálném čase, což poskytuje další výhody oproti klasickému UV/Vis detektoru.

Obrázek 1 ukazuje příklad analýzy kanabinoidů spektrálním absorpčním profilem, který lze použít jako druhou formu potvrzení analytu. Všimněte si, že neutrální kanabinoidy (deta-9-THC, delta-8-ZHC, THCV, CBD, CBDV a CBG) v modrých stopách mají podobný spektrální profil, který se liší od uvedenách kyselých forem (THCA, CBDA a CGBA) v červených stopách. Kyselé kanabinoidy mají funkční skupinu karboxylové kyseliny (-COOH), která poskytuje nižší energii a vyšší maxima absorbance vlnového čísla. PDA může být tedy užitečný při rozlišování mezi analyty s odlišnými absorpčními spektry.

Obrázek 1: Příklad kanabinoidů měřených (U)HPLC s detekcí PDA

V našem příkladu lze PDA použít k rozlišení neutrálních kanabinoidů proti kyselé formy, ale nemělo by se použít k potvrzení kanabioidů ve stejné třídě.

PDA má další výhody v tom, že spektrální profil může pomoci při určování neznámého píku. Pro úplné potvrzení analýzy by ale měla být prováděna detekce pomocí hmotnostní spektrometrie.

Ve farmaceutickém průmyslu se PDA často používá ke stanovení maximální čistoty cílové sloučeniny. Spektra absorbance jsou porovnávána ve více bodech napříč píkem pro podobnost a rozdíly ukázané na obrázku 2. Software sám automaticky indikuje, zda nedošlo ke co-eluci více látek v jednom píku, pomocí indexu čistoty píku.

Obrázek 2: Zjednodušené schéma měření čistoty látek napříč chromatografickým píkem ve srovnání se spektrální absorbancí

Nové funkce i-PDeA

Shimadzu nabízí výkonné rozšíření spektrálních schopností detekce diodového pole. Funkce i-PDeA poskytuje dekonvoluci píků (virtuální oddělení chromatograficky nevyřešených píků). Vzhledem k tomu, že detektor PDA shromažďuje jak časové informace (chromatogram), tak i spektrální informace (UV spektrum), obrázek 3, je možné dekonvoluovat data a určit množství každého analytu v co-eluujícím píku.

Obrázek 3: Dekonvoluce i-PDeA koeluujících píků s využitím časové informace (chromatogramu) i spektrální informace (UV spektrum)

Tato technika se snadno používá a má velkou schopnost vytvářet kvantitativní výsledky z virtuálné separovaných píků. Dekonvoluce i-PDeA se opírá o spolehlivé vědecké principy, nikoli o odhad založený na gaussovském modelování, které se používalo v minulosti.