Základy vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) - PUMPY A GRADIENT

Úvod do HPLC

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) je proces separace složek v kapalné směsi. Kapalný vzorek se vstřikuje do proudu rozpouštědla (mobilní fáze) proudícího přes kolonu naplněnou separačním médiem (stacionární fází). Komponenty vzorku se od sebe oddělují procesem diferenciální migrace, jak procházejí kolonou.

Shimadzu: Separace jednotlivých komponent nesených mobilní fází na chromatografické koloně

Jak se pásy (komponenty) postupně eluují z kolony, tok je přenáší k jednomu nebo více detektorům, které dodávají napěťovou odezvu jako funkci času. Tomu se říká chromatogram. Identifikace složky vzorku značí čas píku, kdy se objeví v chromatogramu s ohledem na standard. Plocha píku představuje množství.

Shimadzu: Jednotlivé separované složky vs. chromatografický záznam

Základní komponenty HPLC

• Vakuový odplyňovač (Degassér) – odstraňuje vzduchové plyny z rozpouštědla (mobilní fáze) při jeho proudění do HPLC čerpadla.

• HPLC pumpa – zajišťuje stálý průtok rozpouštědla nebo případně také dávkování vzorku.

• Autosampler – nabírá vzorky z vialek a vstřikuje je do toku rozpouštědla poskytovaného pumpu.

• Detektor – reaguje na separované analyty vycházející z HPLC kolony a poskytuje výstupní signál/odezvu pro software.

• Kolonový termostat – je místem pro umístění HPLC kolony a udržuje stabilní teplotu pro reprodukovatelnou separaci.

Shimadzu: Základní komponenty HPLC - UHPLC systému

Izokratické vs. gradientové režimy

Izokratická eluce

• Po dobu separace se používá jedno konstantní složení rozpouštědel
• Později eluující píky jsou širší než dříve eluující píky kvůli disperzi
• Je nezbytné pravidelně proplachovat kolonu rozpouštědlem o vyšší síle, aby se vyčistila od nepoddajných složek, které se v koloně hromadí po nástřiku vzorku

Gradientová eluce

• Složení rozpouštědel se mění kontinuálně nebo krokově
• Obecně jsou píky na celém chromatogramu ostřejší ve srovnání s izokratickou elucí
• Mohou být dosaženy určité separace, které nelze dosáhnout pomocí izokratické eluce
• Doba analýzy může být kratší ve srovnání s izokratickou elucí

Izokratické a gradientové režimy pump

Izokratické čerpadlo

Jednokanálové čerpadlo, které vyžaduje, aby uživatel předem připavil a promíchal mobilní fázi. Složení zůstává konstantní s časem.

Kvartérní nízkotlaké gradientové čerpadlo

Čtyřkanálové čerpadlo, které pod softwarovou kontrolou vytváří směs rozpouštědla až ze 4 složek. Míchání se provádí před hlavami čerpadel v nízkotlaké části systému. Složení rozpouštědla se může časem měnit

Binární vysokotlaké gradientové čerpadlo

Dvoukanálové čerpadlo, které pod kontrolou vytváří směs ze 2 rozpouštědel. Míchání se provádí za hlavami ve vysokotlaké části systému. Složení se může časem měnit.

Shimadzu: LabSolutions program pumy – Screening Gradient

Screening Gradient – výkonný pro vývoj metod

Shimadzu: Screening Gradient

Interpretace: U LC kolony s reverzní fází, kde složka A je voda a B organická fáze, tento první run ukazuje složky vzorku, které jsou všechny polární. Separace je tedy špatná, protože látky se ve stacionární fázi málo dělí. Jinými slovy, slabý výchozí stav rozpouštědla eluuje vzorky příliš brzy.

Shimadzu - Průběh HPLC gradientu.png

Aby se látky více rozdělovaly do stacionární fáze, snížime sklon gradientu, čímž se síla mobilní fáze nebude zvyšovat tak rychle. Látky zůstávají delší dobu ve stacionární fázi a začínají se od sebe oddělovat. Všimněte si, že kolonu stále na konci cyklu „propláchneme“ silným rozpouštědlem, abychom kolonu účinně vyčistili.

Dále snižujeme sklon gradientu, dokud v časovém rámci nevidíme dobrou separaci látek.

Shimadzu: Snižování sklonu HPLC gradientu

Ve druhé části série o základech a principech v HPLC /UPLC se podíváme na nejběžnější detektory a teorii k HPLC kolonám.

Další detailnější informace k základům v kapalinové chromatografie můžete najít ve více než 20-ti Shimadzu publikacích v Knihovně nebo v sérii 5-ti komplexních Shimadzu Webinářů - LC Teorie a Klíčové principy dostupných ze záznamu.