Všechny <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=48&amp;distributorItems=51">HPLC kolony Phenomenex</a> jsou před odesláním testovány v rámci kontroly kvality a uchovány v rozpouštědle, které je obecně stejné jako testovací rozpouštědlo, pokud není uvedeno jiné v CQA dokumentu dodávaném s kolonou.„Kondicionování kolony“ nebo „aktivace“ jsou termíny, které se často používají zaměnitelně. Jednoduše řečeno se tak označují kroky, podniknuté ke změně rozpouštědla ve kterém je kolona uchována, na rozpouštědla specifická pro danou analytickou metodu.<div><div>Při zvažování, jaké kondicionování je nutné, je třeba věnovat pozornost následujícímu:<ul><li>Přepravní rozpouštědlo</li><li>Požadovaná mobilní fáze pro analýzu</li></ul>Je třeba zvážit následující otázky:<ul><li>Jsou tyto dva systémy rozpouštědel mísitelné?</li><li>Obsahuje konečný systém rozpouštědel pufry, které se mohou vysrážet?</li></ul><figure class="image"><img style="aspect-ratio:400/247;" src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Kinetex_Core_Shell_HPLC_Columns_a720e2efe5.webp" alt="Phenomenex: Kinetex Core-Shell HPLC Columns" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Kinetex_Core_Shell_HPLC_Columns_a720e2efe5.webp 245w," sizes="100vw" width="400" height="247"></figure></div></div><div><div>Při práci s kolonami s reverzní fází, které se obvykle dodávají ve směsi acetonitril:voda v poměru 65:35 a obecně se používají se směsmi buď methanolu nebo acetonitrilu s vodou nebo pufrem, je často možné přejít přímo do plánované mobilní fáze. Pokud jsou koncentrace pufru vyšší než 20 mM, může být nutné nejprve přejít na nový poměr organiky a vody před přídavkem pufru, aby se snížilo jakékoli riziko vysrážení solí.Malý počet stacionárních fází (kyano, amino, diol) může být použit v normální fázi nebo v reverzní fázi. Obvykle se dodávají ve směsích s normální fází, a pokud mají být použity za podmínek reverzní fáze, je vyžadována výměna přes univerzálně mísitelné rozpouštědlo, pro které lze použít následující protokol:<ul><li>Přepravní rozpouštědlo hexan:ACN v poměru 99:1</li><li>Požadovaná mobilní fáze methanol:voda v poměru 50:50</li><li>Propláchněte kolonu THF nebo IPA v množství 30 objemů kolony</li><li>Propláchněte methanolem v množství 10 objemů kolony</li><li>Propláchněte směsí methanol:voda v poměru 50:50, dokud nedosáhnete stabilní základní linie (baseline)</li></ul>V tomto procesu se nejprve použije THF nebo IPA k odstranění hexanu z kolony. To je důležité, protože hexan se nemísí s methanolem ani vodou. Methanol pak nahradí THF nebo IPA v koloně před vlastní mobilní fázi. Při výběru mezi THF a IPA je třeba vzít v úvahu jaký HPLC systém používáte. Pokud jsou hadičky systému nebo armatury vyrobeny z PEEKu, nelze použít THF, a proto je preferována IPA. Pokud je systém z nerezové oceli, lze použít THF nebo IPA. THF má výhodu nižší viskozity.Při kondicionování kolony pro použití v gradientovém systému je dobrou praxí propláchnout kolonu silným rozpouštědlem (obecně rozpouštědlem B) před ekvilibrací kolony v počátečním bodě gradientu. Pomůže to zajistit, aby kolona poskytovala dobrou základní linii při spuštění gradientu. Před nástřikem testovacího standardu je rovněž dobré udělat dva nebo tři slepé gradienty.Často vyvstává otázka: „Jak poznám, že je kolona plně kondicionována?“ Existují dva užitečné způsoby, jak to určit.<ul><li>Při použití UV detektoru by měla být základní linie (baseline) plochá. Obecně při změně složení rozpouštědla se základní linie bude svažovat. Její vyrovnání je dobrá známka toho, že kolona dosáhla rovnováhy s mobilní fází a je připravena k použití.</li><li>Zpětný tlak: Při výměně rozpouštědel, buď během kondicionování nové kolony, nebo na konci gradientu, se zpětný tlak měřený systémem změní. Postupem času se tlak stabilizuje, což ukazuje, že kolona je ekvilibrována. To může být užitečné při práci se systémy MS, kde obecně není sledována základní linie (baseline).</li></ul></div></div>

Kondicionování/aktivace HPLC kolon

Jednou z nejčastějších příčin krátké životnosti kolony je kontaminace kolony, která často vede k vysokému zpětnému tlaku a takzvané „ucpané“ vstupní fritě.Tento technický tip si klade za cíl vysvětlit, co se děje, a také jak se lze vyhnout kontaminaci kolony.Při výrobě kolon pro HPLC a UHPLC na bázi částic se frity používají k zabránění vstupu cizího materiálu do kolony a k zabránění tomu, aby náplň z HPLC kolon neunikala. Tyto frity jsou kotouče z porézního kovu, obecně o porozitě 0,5, 1,0 nebo 2,0 µm. Pokud vzorky obsahují nerozpuštěný materiál, bude odfiltrován z proudu rozpouštědla mobilní fáze, který se nachází na vnější straně vstupní frity. Jak tento proces pokračuje, dostupný povrch frity pro průchod mobilní fáze se zmenšuje, což omezuje tok mobilní faze a zvyšuje protitlak. Nakonec je téměř nemožné protlačit rozpouštědlo přes fritu a čerpadlo HPLC se vypne.Tomuto procesu lze zabránit filtrací vzorků před nástřikem do HPLC systému. Obecně se doporučuje používat 0,45 µm porézní <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/products/phenex-syringe-filters?_gl=1*befa9s*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*MTc0MjI4MDQ5NC4yLjAuMTc0MjI4MDQ5NC4wLjAuMA..">stříkačkové filtry </a>pro vzorky, které budou měřeny na 5 µm kolonách, 0,2 µm filtry pro 3 µm kolony a menší. Je třeba dbát na to, aby v ideálním případě rozpouštědlo přidávané ke vzorku odpovídalo mobilní fázi. Pokud tomu tak není, můžete se stát, že některé složky vzorku jsou rozpustné v rozpouštědle přidávaného ke vzorku, což jim umožňuje projít filtrem injekční stříkačky.Když jsou vstřikovány do mobilní fáze, mohou se vysrážet a způsobit ucpání frity. Tomu lze předejít buď rozpuštěním vzorku v mobilní fázi, nebo alternativně instalací vstupní frity nebo<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/products/securityguard-lc-guard-cartridge-system?_gl=1*1bfvfj1*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*MTc0MjI4MDQ5NC4yLjAuMTc0MjI4MDQ5NC4wLjAuMA.."> guard cartridge</a> jako spotřebního vyvení, aby se zabránilo znečištění vstupu kolony. &nbsp;<blockquote>Případně máme tento <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://app.explore.phenomenex.com/e/er?s=822460770&amp;lid=8337&amp;elqTrackId=7D1B2E6743B19B5717AFAEFF00F8A51C&amp;elq=00000000000000000000000000000000&amp;elqaid=4836&amp;elqat=2&amp;elqak=8AF5E09C05D0B7BFE5B44C560E3733C27992CF7C906A90E1BF5C55FDC1EA7D8B80B0&amp;_gl=1*1uyr77*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*MTc0MjI4MDQ5NC4yLjAuMTc0MjI4MDQ5NC4wLjAuMA..">webový nástroj</a>, který vás provede výběrem ochranné kazety.</blockquote>

Kontaminace kolon – jak k ní dochází a jak se jí lze vyhnout

Gradientová eluce v HPLC je skvělým nástrojem pro analýzu vzorků, jejichž analyty vykazují široké rozpětí retenčních sil na stacionární fázi zvolené chromatografické kolony. Gradienty však nemusí být vždy ideální z hlediska použití pufrů, zejména pokud se snažíme udržet specifickou hodnotu pH. Pokud je pufr omezen pouze na vodnou mobilní fázi a organická mobilní fáze zůstává čistým organickým rozpouštědlem, může gradient narážet na omezení v rozpustnosti a kolísání pufrační kapacity s rostoucím podílem organické fáze během průběhu gradientu. Tuto nevýhodu lze překonat rovnoměrným rozdělením pufru do obou mobilních fází („slabé“ i „silné“), jak si dále ukážeme na přístupech a příkladech.&nbsp;Co třeba přidat do obou mobilních fází kyselé nebo zásadité aditivum, například 0,1 % (v/v) kyseliny mravenčí (HCO₂H)?&nbsp;Takový přídavek do obou fází může pomoci udržet konzistentní koncentraci aditiva v celkové mobilní fázi během změny poměru mezi „slabou“ a „silnou“ mobilní fází. Nevýhodou tohoto přístupu je však volatilita aditiva, která může způsobit nestabilní protonaci či deprotonaci analytů. A někteří z nás si jistě přiznají, že ne vždy připravujeme (v/v) přídavky zcela přesně. Alternativně lze použít vhodný pufr s odpovídající solí pro konkrétní aditivum, který udrží stálé pH, při kterém je připraven, bez rizika odpařování aditiva.Pufry na bázi mravenčanu amonného (NH₄HCO₂) nebo acetátu amonného (NH₄CH₃CO₂) jsou pro gradientovou eluci nejvhodnější, protože jsou dobře rozpustné v methanolu, zatímco jejich vodné pufry lze mísit i s vysokými poměry acetonitrilu. Potřebná pufrační kapacita bývá zpravidla 5–10 mM v každé fázi. Pro srovnání: při izokratické eluci s mobilní fází 60:40 (20 mM pufr:acetonitril) je výsledná koncentrace pufru pouze 12 mM. Obr. 1 znázorňuje analýzu mykotoxinů na koloně <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/1514">Kinetex™ Bifenyl</a> s 5 mM pufrem acetátu amonného obsaženým ve vodné i methanolové fázi – acetát amonný byl přímo rozpuštěn v methanolu.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_3_788ba526cf.jpg" alt="Phenomenex: Vliv gradientu na pufrační kapacitu: Obrázek 1 – Analýza mykotoxinů na Kinetex Biphenyl (ID aplikace 21951)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_3_788ba526cf.jpg 245w," sizes="100vw" width="904" height="475">Při použití acetonitrilu je třeba jej míchat s vodným pufrem, aby byla zachována rozpustnost pufrovací soli. &nbsp;Obr. 2 znázorňuje HILIC analýzu nederivatizovaných aminokyselin na koloně <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/1542">Biozen™ Glycan</a>, kde byl zásobní pufr (100 mM mravenčan amonný, pH 3,1) přidán do vody i do acetonitrilu v poměru 9:1 (rozpouštědlo:pufr). Výsledná koncentrace pufru v obou fázích byla 10 mM, což udrželo konzistentní pufrační sílu v průběhu gradientu.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_2_bb25c9ae6a.jpg" alt="Phenomenex: Vliv gradientu na pufrační kapacitu: Obrázek 2 – Nederivatizované aminokyseliny na bioZen Glycan (technická poznámka 1264)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_2_bb25c9ae6a.jpg 245w," sizes="100vw" width="987" height="486">Fluorid amonný (NH₄F) se často přidává v malém množství (0,1–0,2 mM) do mobilní fáze pro dosažení vysoce citlivých fluoridových aduktů [M+F]⁻ v režimu ESI⁻ nebo pro podporu tvorby iontů [M+H]⁺ nebo [M+NH₄]⁺ v ESI⁺ režimu. Obr. 3 znázorňuje použití třetího rozpouštědlového kanálu, kterým je 1 mM NH₄F dodáván v konstantním poměru 10 % do celkové mobilní fáze, čímž je zajištěna stálá koncentrace 0,1 mM v celém gradientu. Tato metoda je umožněna ternárními nebo kvarterními pumpami, přičemž se doporučuje izokratické zdržení na začátku metody kvůli lepší přenositelnosti metody mezi různými přístroji. Takové gradienty jsou totiž ovlivněny tzv. „dwell volume“, specifickým pro každý HPLC systém, a to i tehdy, pokud je jedno z rozpouštědel dávkováno konstantně.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_dd2c7475e7.jpg" alt="Phenomenex: Vliv gradientu na pufrační kapacitu: Obrázek 3 – Mikrocystiny na Luna Omega Polar C18 (ID aplikace 23568)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_dd2c7475e7.jpg 245w," sizes="100vw" width="1071" height="550">Dejte si pozor na rozpustnost pufrů, pokud chcete do gradientu zařadit pufry jako hydrogenuhličitan amonný nebo fosfátové pufry, zejména právě fosfátové. Při vyšším obsahu organického rozpouštědla může dojít k precipitaci a doporučuje se nejprve provést studii rozpustnosti. A nakonec – nezapomeňte zahrnout použitý pufr také do ředicího roztoku vzorku, aby bylo pH sladěno s mobilní fází. To zlepší tvar píků i reprodukovatelnost. Gradientová eluce, u níž je udržována konstantní pufrační síla a hodnota pH, významně zvyšuje spolehlivost HPLC metody.

Vliv gradientu na pufrační kapacitu

Při hodnocení dat z HPLC analýzy se pozornost obvykle soustředí na retenční čas, asymetrii píku a účinnost. Tyto parametry umožňují identifikaci a kvantifikaci analytů – čím přesnější jsou tyto informace, tím vyšší je spolehlivost identifikace píku a koncentrace analytu.Kapacitní faktor bývá často opomíjeným parametrem separací, avšak při správném využití může výrazně přispět k vývoji robustnější analytické metody. Kapacitní faktor normalizuje retenční čas analytu vzhledem k rozměrům chromatografické kolony a je definován vztahem:<h5 style="text-align:center;">K' = (tᵣ − t₀) / t₀</h5>kde tᵣ je retenční čas analytu a t₀ je retenční čas nezadržované sloučeniny.Význam kapacitního faktoru lze nejlépe demonstrovat na příkladu:<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_2_f6553ef593.jpg" alt="Phenomenex: Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody? 1. Kyselina šťavelová, 2. Kyselina vinná, 3. Kyselina glykolová, 4. Kyselina mravenčí, 5. Kyselina pyrohroznová, 6. Kyselina malonová, 7. Kyselina octová, 8. Kyselina maleinová, 9. Kyselina citronová." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_2_f6553ef593.jpg 245w," sizes="100vw" width="547" height="345">Zde máme separaci organických kyselin provedenou na koloně C18, která je stabilní až do 100% vodného prostředí. Mobilní fází je 20 mM fosfátový pufr o pH 2,9 s průtokem 0,7 ml/min. Na první pohled se zdá, že retence kyseliny šťavelové je téměř 4 minuty, ale při bližším pohledu je t₀ pro tuto kolonu přibližně 3,7 minuty. Pokud toto zohledníme, je zřejmé, že kyselina šťavelová – velmi polární dikyselina – nevykazuje prakticky žádnou retenci.<h5 style="text-align:center;">K' = (3,9 – 3,7) / 3,7 = 0,054</h5>To znamená, že kyselina šťavelová tráví během průchodu kolonou jen minimální čas ve stacionární fázi. V takových případech je retence analytu výrazně ovlivněna i drobnými, neúmyslnými změnami parametrů, jako jsou:<ul><li>složení mobilní fáze</li><li>pH mobilní fáze</li><li>síla rozpouštědla vzorku</li><li>teplota</li></ul>Taková metoda pravděpodobně nebude robustní, protože retence kyseliny šťavelové se bude lišit od jednoho běhu ke druhému, mezi různými kolonami nebo mezi šaržemi mobilní fáze.Z toho vyplývá doporučení, aby se při vývoji metod udržovaly kapacitní faktory v rozmezí 2–10. Viděli jsme potenciální problémy s kapacitními faktory menšími než 2, ale proč se zastavit právě na horní hranici 10?Při izokratické eluci se šířka píku zvyšuje s rostoucí retenční dobou vlivem difúze. Použití kolon s menšími částicemi a optimalizace průtoku může tento efekt částečně zmírnit, ale nelze jej zcela eliminovat. Navíc vysoké kapacitní faktory vedou k dlouhým retenčním časům, což je v rutinním laboratorním provozu obecně nežádoucí.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_22b7c55c44.jpg" alt="Phenomenex: Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody? 1. Hydrokortizon, 2. Kortikosteron, 3. 11-a-hydroxytestosteron, 4. Kortizon acetát, 5. 11-ketoprogesteron." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_22b7c55c44.jpg 245w," sizes="100vw" width="685" height="339">Zde máme příklad analýzy steroidů na koloně o rozměrech 150 × 4,6 mm při průtoku 1 ml/min. 11-etoprogesteron eluoval přibližně po 17,5 minutách s kapacitním faktorem přibližně 10,6. Za těchto podmínek izokratické eluce je patrné, že došlo k rozšíření píků, což naznačuje, že poslední eluující analyty jsou na koloně zadržovány příliš dlouho.Porozumění obecnému doporučení (kapacitní faktory mezi 2 a 10) je užitečné, ale zůstává otázkou, jak kapacitní faktor účinně upravit?Kapacitní faktor je nepřímo úměrný eluční síle mobilní fáze – vyšší eluční síla snižuje kapacitní faktor a naopak. Pokud nelze nízký kapacitní faktor zvýšit snížením eluční síly mobilní fáze, může být vhodné přejít na stacionární fázi, která nabízí vyšší retenci analytů, například zvolit polárnější stacionární fázi pro separaci polárních analytů.

Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody?

Silikagel používaný k plnění HPLC kolon je polymerem křemíku a kyslíku s povrchovými skupinami Si–OH (silanoly). Na tyto silanolové skupiny se navazují funkční skupiny pomocí silanizačního činidla za účelem funkcionalizace základního nosiče.Při funkcionalizaci HPLC kolon není možné dosáhnout 100% pokrytí fáze ani navázat všechny dostupné silanolové skupiny (volné hydroxylové skupiny na povrchu silikagelu) na stacionární fázi. Vlivem sterických překážek se s postupujícím navazováním fáze zvyšuje prostorové omezení, takže další reakce jsou obtížnější než ty předchozí.Bez end-cappingu by na koloně zůstalo značné množství přístupných, vysoce reaktivních zbytkových silanolových skupin, které mohou ovlivnit selektivitu stacionární fáze. Tyto zbytkové skupiny mohou vytvářet silné iontové a polární interakce (často označované jako „sekundární interakce“) s polárními a bazickými skupinami v analyzovaných sloučeninách. Proto je snížení počtu volných silanolů po navázání stacionární fáze pomocí end-cappingu nezbytné.Historicky se k end-cappingu používaly malé hydrofobní skupiny, povahou podobné trimethylsilanu. V posledních letech někteří výrobci zavedli další typy skupin, které dodávají koloně <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://app.explore.phenomenex.com/e/er?s=822460770&amp;lid=6998&amp;elqTrackId=D5A4A87A868E75FA6693FC5A1E9B3C89&amp;elq=00000000000000000000000000000000&amp;elqaid=5674&amp;elqat=2&amp;elqak=8AF5A07C3CDAC28222BF387672C6F595E7A5CF7C906A90E1BF5C55FDC1EA7D8B80B0&amp;_gl=1*175w36l*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*czE3NTAwMTE2NzAkbzI1JGcwJHQxNzUwMDExNjcwJGo2MCRsMCRoMA..">nový selektivní prvek</a>.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_a458911946.jpg" alt="Phenomenex: Úloha end-cappingu v reverzní fázi (RP)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_a458911946.jpg 245w," sizes="100vw" width="767" height="214">Pokud end-cappingové činidlo obsahuje nabité funkční skupiny, propůjčuje povrchu iontoměničovou funkci a dává koloně iontoměničové vlastnosti spolu s <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://app.explore.phenomenex.com/e/er?s=822460770&amp;lid=8525&amp;elqTrackId=63166B02CED6893A95911CAE6AA3AE95&amp;elq=00000000000000000000000000000000&amp;elqaid=5674&amp;elqat=2&amp;elqak=8AF5B477F9C56C31BC7CAC9FBFB946361A9ECF7C906A90E1BF5C55FDC1EA7D8B80B0&amp;_gl=1*1vag7yn*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*czE3NTAwMTE2NzAkbzI1JGcwJHQxNzUwMDExNjcwJGo2MCRsMCRoMA..">reverzně-fázovými interakcemi</a> vycházejícími z C18 ligandů. Podobně polární skupiny dodávají povrchu polární charakter.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_4_e1b1855040.jpg" alt="Phenomenex: Úloha end-cappingu v reverzní fázi (RP)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_4_e1b1855040.jpg 245w," sizes="100vw" width="786" height="246">Nyní, když jsme si vysvětlili roli end-cappingu, shrňme si hlavní přínosy funkcionalizace silikagelu v závislosti na použitých chemických skupinách.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_3_be82757ab7.jpg" alt="Phenomenex: Úloha end-cappingu v reverzní fázi (RP)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_3_be82757ab7.jpg 137w," sizes="100vw" width="640" height="728">Stručně řečeno, nové technologie end-cappingu mohou významně zlepšit analýzu sloučenin, které dříve představovaly chromatografickou výzvu. Například dnes lze dosáhnout vynikajícího tvaru píků a kratších retenčních časů při analýze bazických léčiv pomocí <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=341&amp;manufacturerItems=50&amp;search=PS">kolon PS-C18</a>. Fáze <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=341&amp;manufacturerItems=50&amp;search=polar">Polar C18</a> se osvědčila pro retenci metabolitů a fáze <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=341&amp;manufacturerItems=50&amp;search=XB">XB-C18 </a>poskytuje výbornou chromatografii peptidů, s výrazně vyšší retencí malých polárních peptidů.

Úloha end-cappingu v reverzní fázi (RP)

V tomto technickém tipu se zaměříme na běžný problém asymetrie píku (tzv. tailing), který se objevuje při analýze bazických sloučenin na silikagelu typu A, a představíme dvě strategie, jak tento jev omezit.<h4>Úvod:</h4>První kolony pro chromatografii na reverzní fázi byly založeny na silikagelu typu A. Tyto materiály obsahovaly významné množství kovových nečistot, které způsobovaly, že silanolové skupiny na povrchu siliky vykazovaly zvýšenou a proměnlivou aktivitu. Výrobci se snažili tyto skupiny co nejvíce deaktivovat (endcappingem) po navázání C18 ligandů, aby omezili místa, kde může docházet k iontové výměně. Přesto však bazické sloučeniny často vykazovaly výrazné chvostování. Podívejme se, jak lze toto omezení překonat.<h4>Strategie pro zlepšení tvaru píku:</h4><ul><li>Práce při nízkém pH pomáhá neutralizovat silanolové skupiny na povrchu siliky a zabránit tak iontové výměně. Pro tento účel je vhodný 10–20mM fosfátový pufr o pH 2,5. Při použití acetonitrilu jako organického rozpouštědla je však třeba dbát opatrnosti, aby nedošlo k vysrážení pufru při gradientové eluci.</li><li>Přidání konkurenční báze (tzv. silanolového supresoru) do mobilní fáze. Nejčastěji se používá TEA (triethylamin) v koncentraci 5 mM. Tento přístup funguje na principu, že konkurenční báze se váže na aniontové silanolové skupiny, čímž snižuje jejich dostupnost pro interakce s analyty. Ačkoli je tato strategie účinná, může zkracovat životnost kolony, protože silanolové supresory urychlují hydrolýzu stacionární fáze i endcappingu, což následně zvyšuje expozici siliky a vede k zhoršení tvaru píku.</li></ul>Tyto strategie mohou výrazně omezit chvostování píků, ale nemusí jej zcela eliminovat, jak ukazují chromatogramy na obrázcích A a B.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Overcoming_Peak_Tailing_of_Basic_Analytes_in_Silica_Type_A_Stationary_Phases_in_RP_4c1effe7d3.jpg" alt="Phenomenex: Omezení tailingu bázických analytů při chromatografii na stacionární fázi ze silikagelu typu A v reverzní fázi: A) Mobilní fáze: 20 mM fosforečnanový pufr draselný, pH = 2,5 : methanol (70:30), průtok: 1 mL/min, detekce: UV-Vis při 254 nm; B) Mobilní fáze: 20 mM fosforečnanový pufr draselný, pH = 3 s 400 µL/L triethylaminu : acetonitril (63:37), průtok: 1 mL/min, detekce: UV-Vis při 230 nm." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Overcoming_Peak_Tailing_of_Basic_Analytes_in_Silica_Type_A_Stationary_Phases_in_RP_4c1effe7d3.jpg 245w," sizes="100vw" width="939" height="332">Obrázek A ukazuje, jak kyselé pH mírně zlepšuje tvar píku benzylaminu, zatímco obrázek B zachycuje výraznější zlepšení po přidání triethylaminu jako modifikátoru.<blockquote>Při vývoji nových separačních metod doporučujeme používat silikagel typu B (ultračistý). Plně porézní <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=341&amp;manufacturerItems=50&amp;search=omega">kolony Luna™ Omega</a> i kolony <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=339&amp;manufacturerItems=50&amp;search=kinetex+">Kinetex™ Core-Shell</a> poskytují vynikající tvar píků i u náročných bazických analytů.</blockquote>

Omezení chvostujících píků bazických analytů při chromatografii na reverzní fázi se silikagelovou stacionární fází typu A

Jednou z nejčastějších příčin krátké životnosti kolony je její kontaminace, která často vede k vysokému protitlaku a takzvanému „ucpání“ vstupní frity.Tento technický tip má za cíl vysvětlit, co se při tom děje, a také jak lze kontaminaci kolony předcházet.Při výrobě HPLC a UHPLC kolon plněných částicemi se používají frity, které zabraňují vniknutí cizorodých látek do kolony a zároveň brání ztrátě stacionární fáze. Tyto frity jsou porézní kovové disky s velikostí pórů obvykle 0,5, 1,0 nebo 2,0 μm. Pokud vzorky obsahují nerozpuštěný materiál, zachytí se na vnější straně vstupní frity. Jak tento proces pokračuje, průtočná plocha frity se zmenšuje, což omezuje průtok mobilní fáze a tím dochází ke zvýšení protitlaku. Nakonec se stane nemožné protlačit rozpouštědlo fritou a HPLC čerpadlo se zastaví.Tomu lze předejít filtrací vzorků před vstřikováním do HPLC systému. Obecně se doporučuje používat stříkačkové filtry s porézností 0,45 μm pro vzorky analyzované na 5μm kolonách a 0,2 μm filtry pro 3μm kolony a menší. Je třeba dbát na to, aby rozpouštědlo vzorku ideálně odpovídalo mobilní fázi. Pokud tomu tak není, mohou být některé složky vzorku rozpustné v rozpouštědle a projdou tak filtrem. Při vstřiku do mobilní fáze se však mohou vysrážet a ucpat fritu. Tomu lze zabránit buď rozpuštěním vzorku přímo v mobilní fázi, nebo instalací vstupní frity či předkolony jako obětního prvku, který zabrání znečištění samotného vstupu kolony.Alternativně můžete využít i náš <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/tools/security-guard-selection#bybrand">webový nástroj</a>, který vás provede výběrem vhodné předkolony.

Kontaminace kolony – co se děje a jak tomu lze zabránit

Peptidy se při vývoji chromatografických metod pro jejich analýzu často považují za látky bližší malým molekulám. Ve skutečnosti však představují most mezi malými molekulami (tradičními léčivy) a většími biomolekulami (proteiny, AAV nebo oligonukleotidy). Při analýze peptidů nelze jednoduše vycházet z vlastností jednotlivých aminokyselin, protože charakteristika peptidu závisí nejen na těchto stavebních jednotkách, ale také na jejich vazebném uspořádání v peptidovém řetězci a na způsobu, jakým je tento řetězec stočen nebo složen v prostoru. Z tohoto důvodu se peptidy mohou při analýze HPLC chovat jinak než malé molekuly.Počáteční vývoj metody pro analýzu peptidů by měl začínat chemickým screeningem, během kterého se testují různé stacionární fáze, počínaje běžnou alkylovou fází. Pokud dosažený chromatografický profil neposkytuje požadovanou selektivitu, doporučuje se přejít na jiný typ fáze – ideálně s výrazně odlišnými vlastnostmi.Gradient mobilní fáze je rovněž důležitou proměnnou, kterou je nutné při analýze peptidů zohlednit. Typicky se používají mnohem pozvolnější gradienty než u názkomolekulárních látek. Pro optimalizaci gradientu při analýze peptidů doporučujeme začít s nízkým podílem fáze B (organické složky), aby se peptidy soustředily na čelo kolony, a poté použít pozvolný nárůst až na 50–60 % organické fáze, při kterém by měly eluovat všechny peptidy (běžný je nárůst o 1 % B za minutu).Je třeba zohlednit také pH roztoku, ve kterém je vzorek připraven, a mobilní fáze, protože ovlivňuje fyzikálně-chemické vlastnosti peptidů a tím i jejich retenční časy. Dále je vhodné věnovat pozornost typu elučního rozpouštědla – pro peptidy se obvykle používá acetonitril.Po provedení počátečního screeningu lze přistoupit k optimalizaci metody úpravou dalších parametrů (tab. 1). Nejsilnější vliv na selektivitu má pH (obr. 1).<h5>Tab. 1 Proměnná | Řešení</h5><ul><li>Průtok: Má menší vliv na peptidy než na malé molekuly</li><li>pH: I malá změna může mít velký dopad</li><li>Gradient: Změny gradientu významně ovlivňují selektivitu</li><li>Teplota: 40–90ºC</li><li>Typ pufru: Různé možnosti, např. TFA, kyselina mravenčí, HFBA, fosfátové pufry</li></ul><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_A_Systematic_Approach_to_Peptide_Analysis_3_fbd3281d82.jpg" alt="Phenomenex: Systematický přístup k analýze peptidů: Obrázek 1." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_A_Systematic_Approach_to_Peptide_Analysis_3_fbd3281d82.jpg 219w," sizes="100vw" width="784" height="558"><ul><li>Kolona:&nbsp;<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/1512">Kinetex EVO C18 5µm</a></li><li>Rozměry: 250 × 4,6 mm</li><li>Objednací číslo: 00D-4790-AN</li><li>Mobilní fáze A: 50 mM octan amonný ve vodě; acetonitril (v/v 97:3), pH dle pokynů</li><li>Mobilní fáze B: 50 mM octan amonný ve vodě; acetonitril (v/v 60:40), pH dle pokynů</li><li>Gradient: 14–34 % B, 40 minut, následně nárůst na 80 %</li><li>Průtok: 1,5 ml/min</li><li>Teplota: 65 °C</li><li>Detekce: UV-Vis @ 220 nm</li><li>Vzorek: Syntetický 12-aminokyselinový peptid s příbuznými syntetickými nečistotami</li></ul>Stacionární fáze hraje klíčovou roli při vývoji metody, a proto se doporučuje testovat různé typy (obr. 2).<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_A_Systematic_Approach_to_Peptide_Analysis_2_3736b8feab.jpg" alt="Phenomenex: Systematický přístup k analýze peptidů: Obrázek 2." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_A_Systematic_Approach_to_Peptide_Analysis_2_3736b8feab.jpg 245w," sizes="100vw" width="767" height="334"><h3>Závěr</h3>Zavedení systematického přístupu k vývoji metod pro analýzu syntetických peptidů umožňuje přesné stanovení a purifikaci peptidů v robustním a spolehlivém analytickém procesu. Screening chemického složení stacionární fáze a pH je zásadní a vyžaduje dobře pufrované a stabilně řízené systémy. Uplatnění principů Quality by Design (QbD) celý proces zjednodušuje a spojuje všechny klíčové faktory během vývoje metody.

Systematický přístup k analýze peptidů v HPLC

V tomto technickém tipu se zaměříme na častý problém chvostování píků, který se objevuje při analýze bazických analytů na silikagelech typu A, a představíme dvě strategie, jak tento jev omezit.<h4>Úvod</h4>První kolony pro reverzní fázi (RP) byly založeny na tzv. silikagelech typu A. Tyto materiály obsahovaly významné množství kovových nečistot, které způsobovaly vyšší a proměnlivější aktivitu silanolových skupin na povrchu silikagelu. Výrobci se snažili tento problém zmírnit „endcappingem“, tedy dodatečnou reakcí zbylých silanolových skupin po navázání C18 reagentů, aby snížili počet míst, kde může docházet k iontové výměně.Přesto však bazické sloučeniny často vykazovaly výrazné chvostování píků. Podívejme se proto, jak lze tuto nevýhodu překonat.<h4>Strategie pro zlepšení tvaru píků</h4><h5>1. Práce při nízkém pH</h5>Práce při nízkém pH může pomoci neutralizovat silanolové skupiny na povrchu silikagelu a tím zabránit iontové výměně. Pro tento účel je ideální 10–20 mM fosfátový pufr s pH 2,5.Je však nutné dávat pozor při použití acetonitrilu jako organického rozpouštědla, protože při gradientové eluci může dojít k vysrážení pufru.<h5>2. Přidání konkurenční báze (silanolového supresoru)</h5>Dalším přístupem je přidání konkurenční báze do mobilní fáze. Jako přísady se často používá triethylamin (TEA) v koncentraci kolem 5 mM.Princip spočívá v tom, že konkurenční báze se váže na aniontové silanolové skupiny, a tím snižuje jejich dostupnost pro interakci s analyty. Tento přístup je sice účinný, ale obvykle vede ke zkrácené životnosti kolony, protože silanolové supresory mohou urychlit hydrolýzu stacionární fáze i endcappingu. Tím se odhaluje více aktivního povrchu silikagelu a chvostování píků se může znovu objevit.<h4>Ukázky chromatogramů</h4>Tyto strategie pomáhají chvostování píků výrazně omezit, ale nemusí jej zcela odstranit, jak ukazují níže uvedené chromatogramy:<ul><li>Obrázek A (Phenomenex): mírné zlepšení tvaru píku benzylaminu při použití kyselého pH</li></ul><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Figure_A_shows_the_moderate_effect_of_using_an_acidic_p_H_to_mitigate_tailing_for_benzylamine_8f5b77d7ad.jpg" alt="Phenomenex: Obrázek A" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Figure_A_shows_the_moderate_effect_of_using_an_acidic_p_H_to_mitigate_tailing_for_benzylamine_8f5b77d7ad.jpg 245w," sizes="100vw" width="1153" height="732"><ul><li>Obrázek B (Phenomenex): výsledná chromatografie po přidání triethylaminu jako modifikátoru</li></ul><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Figure_B_shows_the_resulting_chromatography_after_adding_triethylamine_as_a_modifier_c7a4d2b39c.jpg" alt="Phenomenex: Obrázek B" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Figure_B_shows_the_resulting_chromatography_after_adding_triethylamine_as_a_modifier_c7a4d2b39c.jpg 244w," sizes="100vw" width="1299" height="831"><h4>Doporučení: použijte silikagel typu B</h4>Pro vývoj nových separací doporučujeme používat silikagel typu B (ultračistý). Kolony <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/1528">Luna™ Omega</a> (plně porézní) a <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=48&amp;manufacturerItems=50&amp;search=kinetex+core-shell">Kinetex™ Core-Shell</a> poskytují vynikající tvar píků i pro náročné sloučeniny.<blockquote><h5><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/tn64610319_w_dce3222b7c.pdf">Zvýšení účinnosti a snížení asymetrie píků</a></h5>Dalším krokem ke zvýšení účinnosti separace je optimalizace připojení kolony. Systém SecurityLINK™ PEEKsil Fingertight Fitting zlepšuje těsnění a přenos signálu, což přispívá k vyšší účinnosti a menší asymetrii píků na optimalizovaném chromatografickém systému.</blockquote>

Jak překonat chvostování píků u bazických analytů: stacionární fáze typu A v reverzní fázi (RP)

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Společnost Phenomenex je celosvětovým technologickým lídrem, který se zabývá vývojem nových řešení v oblasti analytické chemie, jež řeší požadavky analytiků na separace a purifikace v průmyslových, vládních a akademických laboratořích.

Phenomenex

Moderní elektroanalytické metody (Cena Metrohm 2026)

ALS Kurz Analýzou HYDRAULICKÝCH a TURBÍNOVÝCH olejů k větší efektivitě výroby

Praktický kurz ŠKOLA HPLC

Big Scale, Big Wins: Prep Chromatography Explained

High-throughput stability screening strategies for antibody formulation

PFAS in Food & Food Contact Material