Jak překonat chvostování píků u bazických analytů: stacionární fáze typu A v reverzní fázi (RP)

V tomto technickém tipu se zaměříme na častý problém chvostování píků, který se objevuje při analýze bazických analytů na silikagelech typu A, a představíme dvě strategie, jak tento jev omezit.

Úvod

První kolony pro reverzní fázi (RP) byly založeny na tzv. silikagelech typu A. Tyto materiály obsahovaly významné množství kovových nečistot, které způsobovaly vyšší a proměnlivější aktivitu silanolových skupin na povrchu silikagelu. Výrobci se snažili tento problém zmírnit „endcappingem“, tedy dodatečnou reakcí zbylých silanolových skupin po navázání C18 reagentů, aby snížili počet míst, kde může docházet k iontové výměně.

Přesto však bazické sloučeniny často vykazovaly výrazné chvostování píků. Podívejme se proto, jak lze tuto nevýhodu překonat.

Strategie pro zlepšení tvaru píků

1. Práce při nízkém pH

Práce při nízkém pH může pomoci neutralizovat silanolové skupiny na povrchu silikagelu a tím zabránit iontové výměně. Pro tento účel je ideální 10–20 mM fosfátový pufr s pH 2,5.

Je však nutné dávat pozor při použití acetonitrilu jako organického rozpouštědla, protože při gradientové eluci může dojít k vysrážení pufru.

2. Přidání konkurenční báze (silanolového supresoru)

Dalším přístupem je přidání konkurenční báze do mobilní fáze. Jako přísady se často používá triethylamin (TEA) v koncentraci kolem 5 mM.

Princip spočívá v tom, že konkurenční báze se váže na aniontové silanolové skupiny, a tím snižuje jejich dostupnost pro interakci s analyty. Tento přístup je sice účinný, ale obvykle vede ke zkrácené životnosti kolony, protože silanolové supresory mohou urychlit hydrolýzu stacionární fáze i endcappingu. Tím se odhaluje více aktivního povrchu silikagelu a chvostování píků se může znovu objevit.

Ukázky chromatogramů

Tyto strategie pomáhají chvostování píků výrazně omezit, ale nemusí jej zcela odstranit, jak ukazují níže uvedené chromatogramy:

• Obrázek A (Phenomenex): mírné zlepšení tvaru píku benzylaminu při použití kyselého pH

Phenomenex: Obrázek A

• Obrázek B (Phenomenex): výsledná chromatografie po přidání triethylaminu jako modifikátoru

Phenomenex: Obrázek B

Doporučení: použijte silikagel typu B

Pro vývoj nových separací doporučujeme používat silikagel typu B (ultračistý). Kolony Luna™ Omega (plně porézní) a Kinetex™ Core-Shell poskytují vynikající tvar píků i pro náročné sloučeniny.

Zvýšení účinnosti a snížení asymetrie píků

Dalším krokem ke zvýšení účinnosti separace je optimalizace připojení kolony. Systém SecurityLINK™ PEEKsil Fingertight Fitting zlepšuje těsnění a přenos signálu, což přispívá k vyšší účinnosti a menší asymetrii píků na optimalizovaném chromatografickém systému.