Omezení chvostujících píků bazických analytů při chromatografii na reverzní fázi se silikagelovou stacionární fází typu A

V tomto technickém tipu se zaměříme na běžný problém asymetrie píku (tzv. tailing), který se objevuje při analýze bazických sloučenin na silikagelu typu A, a představíme dvě strategie, jak tento jev omezit.

Úvod:

První kolony pro chromatografii na reverzní fázi byly založeny na silikagelu typu A. Tyto materiály obsahovaly významné množství kovových nečistot, které způsobovaly, že silanolové skupiny na povrchu siliky vykazovaly zvýšenou a proměnlivou aktivitu. Výrobci se snažili tyto skupiny co nejvíce deaktivovat (endcappingem) po navázání C18 ligandů, aby omezili místa, kde může docházet k iontové výměně. Přesto však bazické sloučeniny často vykazovaly výrazné chvostování. Podívejme se, jak lze toto omezení překonat.

Strategie pro zlepšení tvaru píku:

• Práce při nízkém pH pomáhá neutralizovat silanolové skupiny na povrchu siliky a zabránit tak iontové výměně. Pro tento účel je vhodný 10–20mM fosfátový pufr o pH 2,5. Při použití acetonitrilu jako organického rozpouštědla je však třeba dbát opatrnosti, aby nedošlo k vysrážení pufru při gradientové eluci.
• Přidání konkurenční báze (tzv. silanolového supresoru) do mobilní fáze. Nejčastěji se používá TEA (triethylamin) v koncentraci 5 mM. Tento přístup funguje na principu, že konkurenční báze se váže na aniontové silanolové skupiny, čímž snižuje jejich dostupnost pro interakce s analyty. Ačkoli je tato strategie účinná, může zkracovat životnost kolony, protože silanolové supresory urychlují hydrolýzu stacionární fáze i endcappingu, což následně zvyšuje expozici siliky a vede k zhoršení tvaru píku.

Tyto strategie mohou výrazně omezit chvostování píků, ale nemusí jej zcela eliminovat, jak ukazují chromatogramy na obrázcích A a B.

Phenomenex: Omezení tailingu bázických analytů při chromatografii na stacionární fázi ze silikagelu typu A v reverzní fázi: A) Mobilní fáze: 20 mM fosforečnanový pufr draselný, pH = 2,5 : methanol (70:30), průtok: 1 mL/min, detekce: UV-Vis při 254 nm; B) Mobilní fáze: 20 mM fosforečnanový pufr draselný, pH = 3 s 400 µL/L triethylaminu : acetonitril (63:37), průtok: 1 mL/min, detekce: UV-Vis při 230 nm.

Obrázek A ukazuje, jak kyselé pH mírně zlepšuje tvar píku benzylaminu, zatímco obrázek B zachycuje výraznější zlepšení po přidání triethylaminu jako modifikátoru.

Při vývoji nových separačních metod doporučujeme používat silikagel typu B (ultračistý). Plně porézní kolony Luna™ Omega i kolony Kinetex™ Core-Shell poskytují vynikající tvar píků i u náročných bazických analytů.