Systematický přístup k analýze peptidů v HPLC

Peptidy se při vývoji chromatografických metod pro jejich analýzu často považují za látky bližší malým molekulám. Ve skutečnosti však představují most mezi malými molekulami (tradičními léčivy) a většími biomolekulami (proteiny, AAV nebo oligonukleotidy). Při analýze peptidů nelze jednoduše vycházet z vlastností jednotlivých aminokyselin, protože charakteristika peptidu závisí nejen na těchto stavebních jednotkách, ale také na jejich vazebném uspořádání v peptidovém řetězci a na způsobu, jakým je tento řetězec stočen nebo složen v prostoru. Z tohoto důvodu se peptidy mohou při analýze HPLC chovat jinak než malé molekuly.

Počáteční vývoj metody pro analýzu peptidů by měl začínat chemickým screeningem, během kterého se testují různé stacionární fáze, počínaje běžnou alkylovou fází. Pokud dosažený chromatografický profil neposkytuje požadovanou selektivitu, doporučuje se přejít na jiný typ fáze – ideálně s výrazně odlišnými vlastnostmi.

Gradient mobilní fáze je rovněž důležitou proměnnou, kterou je nutné při analýze peptidů zohlednit. Typicky se používají mnohem pozvolnější gradienty než u názkomolekulárních látek. Pro optimalizaci gradientu při analýze peptidů doporučujeme začít s nízkým podílem fáze B (organické složky), aby se peptidy soustředily na čelo kolony, a poté použít pozvolný nárůst až na 50–60 % organické fáze, při kterém by měly eluovat všechny peptidy (běžný je nárůst o 1 % B za minutu).

Je třeba zohlednit také pH roztoku, ve kterém je vzorek připraven, a mobilní fáze, protože ovlivňuje fyzikálně-chemické vlastnosti peptidů a tím i jejich retenční časy. Dále je vhodné věnovat pozornost typu elučního rozpouštědla – pro peptidy se obvykle používá acetonitril.

Po provedení počátečního screeningu lze přistoupit k optimalizaci metody úpravou dalších parametrů (tab. 1). Nejsilnější vliv na selektivitu má pH (obr. 1).

Tab. 1
Proměnná | Řešení

• Průtok: Má menší vliv na peptidy než na malé molekuly
• pH: I malá změna může mít velký dopad
• Gradient: Změny gradientu významně ovlivňují selektivitu
• Teplota: 40–90ºC
• Typ pufru: Různé možnosti, např. TFA, kyselina mravenčí, HFBA, fosfátové pufry

Phenomenex: Systematický přístup k analýze peptidů: Obrázek 1.

• Kolona: Kinetex EVO C18 5µm
• Rozměry: 250 × 4,6 mm
• Objednací číslo: 00D-4790-AN
• Mobilní fáze A: 50 mM octan amonný ve vodě; acetonitril (v/v 97:3), pH dle pokynů
• Mobilní fáze B: 50 mM octan amonný ve vodě; acetonitril (v/v 60:40), pH dle pokynů
• Gradient: 14–34 % B, 40 minut, následně nárůst na 80 %
• Průtok: 1,5 ml/min
• Teplota: 65 °C
• Detekce: UV-Vis @ 220 nm
• Vzorek: Syntetický 12-aminokyselinový peptid s příbuznými syntetickými nečistotami

Stacionární fáze hraje klíčovou roli při vývoji metody, a proto se doporučuje testovat různé typy (obr. 2).

Phenomenex: Systematický přístup k analýze peptidů: Obrázek 2.

Závěr

Zavedení systematického přístupu k vývoji metod pro analýzu syntetických peptidů umožňuje přesné stanovení a purifikaci peptidů v robustním a spolehlivém analytickém procesu. Screening chemického složení stacionární fáze a pH je zásadní a vyžaduje dobře pufrované a stabilně řízené systémy. Uplatnění principů Quality by Design (QbD) celý proces zjednodušuje a spojuje všechny klíčové faktory během vývoje metody.