Doporučené postupy pro používání HPLC systému Agilent - Úvod

Práce a nakládání s rozpouštědly

• Používejte pouze čisté borosilikátové skleněné lahve.

  • Před novým doplněním vypláchněte láhev příslušným rozpouštědlem.
  • Láhve mohou být kontaminovány čisticími prostředky z myčky nádobí.

• Používejte vstupní filtry pro rozpouštědla pro ochranu systému před cizími částicemi.

• Rozpouštědla s obsahem vody vyměňujte jednou denně.

  • Řasy nebo růst bakterií můžou zablokovat odplynovač nebo filtry.
  • Vysrážené nerozpustné soli můžou zablokovat filtry nebo kapiláry.

• Připravte si objem rozpouštědla, který spotřebujete do 1–2 dnů.

• Používejte pouze rozpouštědla a vodu třídy HPLC.

  • Všechna připravená organická rozpouštědla, směsi a vodné pufry musí být filtrovány přes filtr 0,2 μm.
  • Rezidua nebo kontaminace mohou zablokovat filtry nebo kapiláry.

• Na láhve správně vyznačte obsah a datum plnění a spotřeby.

• Snižte riziko růstu řas: pro vodní rozpouštědla používejte hnědé láhve; láhve nevystavujte slunečnímu záření, nebo je zabalte do hliníkové fólie.

💡 Článek: TEORIE, PRAXE A ÚDRŽBA: HPLC – Vysokoúčinná kapalinová chromatografie – základy a principy

Zvláštní doporučení pro acetonitril (ACN)

• ACN a další organická rozpouštědla lze filtrovat 0,2 μm pomocí filtrační membrány z PTFE (například 5191–4339).

POZNÁMKA: Filtrování pomocí nylonových filtrů se nedoporučuje pro vysoce citlivé LCMS analýzy.

• Použijte hnědé lahve a naplňte je objemem ACN, který se má spotřebovat do 1-2 dnů, aby se zabránilo fotochemickým reakcím a oxidaci.

Jak připravovat vzorky

VAROVÁNÍ: Možné srážení vzorku

• Ujistěte se, že vzorek je zcela rozpustný jak v ředicím roztoku vzorku, tak v mobilní fázi.
• Upravte ředicí roztok vzorku tak, aby co nejvíce odpovídal počátečnímu složení mobilní fáze, aby se zabránilo vysrážení, tlakovým rázům a píkům rozpouštědla v chromatogramu.

• Upřednostňovanou metodou je filtrování nerozpustné frakce ve vzorku přes 0,2 μm filtry a tak zabránění ucpání systému. Není-li to možné, vorky důkladně odstřeďte a dejte pozor, aby nedošlo ke kontaminaci supernatantu sraženinou při jeho dekantování nebo nasávání.

• Ujistěte se, že rozpouštědlo, kterým vzorek ředíme neobsahuje žádné částice.

• Nefiltrované vzorky způsobují ucpávání a kontaminaci průtokových cest, což může mít za následek trvalé zvyšování zpětného tlaku systému a tlakové anomálie, jako jsou zvlnění nebo náhlé poklesy. Změny tlaku mohou ovlivnit reprodukovatelnost chromatografických výsledků.

• Například nefiltrované vzorky proteinů mohou způsobit tvorbu proteinového filmu, který může časem ucpat průtokovou cestu a významně zkrátit životnost chromatografických kolon.

HPST: Proteinový film vytvořený na povrchu PTFE nosiče na horní straně inline filtru (potvrzeno SEM EDX)

• Doporučuje se používat inline filtry, aby se zabránilo vniknutí částic do průtokové cesty a poškození ventilů, kolon a detektoru, viz „Doporučení pro čerpadla a autosampler s volitelným inline filtrem“ v dalších částech seriálu.

Jak vyčistit HPLC systém

• Pokud existuje podezření na bakteriální kontaminaci systému, lze použít následující postup čištění systému.

  • Aplikujte následující roztoky postupně při mírném průtoku (0,5 – 1 ml/min) a to každý po dobu alespoň 30 minut:
    • a. voda
    • b. 0,1 M NaOH
    • c. voda
    • d- 0,13 M HCl
    • e. voda

• Při práci s biokompatibilními pufrovacími systémy (např. fosfát, acetát) je třeba věnovat zvláštní pozornost prevenci tvorby biofilmu.

  • Postup čištění systému (popsaný dříve) musí být proveden, jakmile je pozorován pokles chromatografické reprodukovatelnosti na všech kanálech rozpouštědel, které se používají pro biokompatibilní pufry.

• Při provádění jakéhokoli čisticího postupu HPLC systému se ujistěte, že kolona a detektor jsou vyloučeny z průtokové cesty.

• Chromatografické kolony používané pro separace biomolekul, jako je vylučovací chromatografie nebo iontoměničová chromatografie, by měly být skladovány v přítomnosti 0,02 % azidu sodného.

Denní/týdenní úlohy

Denní úlohy

• Rozpouštědla a láhve s rozpouštědly u mobilní fáze vyměňujte podle množství vody/pufru.

• Rozpouštědla a láhve s rozpouštědly u organické mobilní fáze vyměňujte alespoň každý druhý den.

• Zkontrolujte přítomnost rozpouštědla pro oplach těsnění.

• Každý kanál před použitím proplachujte čerstvým rozpouštědlem při 2,5 – 3 mL/min po dobu 5 min.

• Systém ekvilibrujte složením a průtokem mobilní fáze pro následující metody.

💡 Článek a záznam přednášky: Předcházejte problémům v HPLC s využitím příslušenství Agilent

Týdenní úlohy

• Vyměňte rozpouštědlo pro oplach těsnění (10 % izopropanolu ve vodě) a láhev.

• Pokud byly prováděny aplikace s použitím solí, propláchněte všechny kanály vodou (podrobnosti viz „Postup proplachování“ v dalších dílech) a případné usazeniny soli odstraňte ručně.

• Zkontrolujte nečistoty nebo blokace u filtrů rozpouštědel. Pokud se po odpojení ze vstupu odplynovače neobjeví žádný průtok z dráhy rozpouštědla, proveďte výměnu.

VAROVÁNÍ: Kontaminace rozpouštědla pro oplach těsnění

Poškození pístů a těsnění

• Rozpouštědla pro oplach těsnění nerecyklujte.
• Rozpouštědlo pro oplach těsnění vyměňujte jednou týdně.
• Typická spotřeba rozpouštědla: 0,5 L týdně.
• Důrazně se doporučuje použití sady láhví pro oplach těsnění (5067-6131).

Zapnutí/vypnutí systému

Zapnutí systému

• Zajistěte, aby všechny moduly byly v prostředí se stabilní teplotou a chráněny před přímým slunečním světlem.

• Zapněte všechny moduly a připravte je podle následujících pokynů:

Příprava čerpadla

• Použijte čerstvou nebo jinou mobilní fázi (podle potřeby).

• Každý kanál proplachujte při 2,5 – 3 mL/min po dobu 5 min. Podle typu čerpadla otevřete ruční proplachovací ventil nebo použijte příkaz k proplachu.

Příprava autoampleru

• Nepoužívejte funkci oplachování jehly a zpětného proplachování sedla organickými rozpouštědly při analýzách využívajících pufr, protože by mohlo dojít k vysrážení soli v sedle jehly.

• Při použití oplachu jehly a/nebo zpětného proplachu sedla:

  • Vždy používejte čerstvá rozpouštědla.
  • Dobrou možnost představuje metanol, ACN, izopropanol, voda a jejich směsi.
  • Nepoužívejte mísitelné roztoky ani precipitační mycí roztoky.

• Při použití chlazení/termostatování vzorků

  • Zapněte chladič/termostat a počkejte, dokud nebude dosaženo cílové teploty a dokud se teplota nestabilizuje.
  • To lze provést v době, kdy se zahřívá se lampa detektoru.

• Ujistěte se, že vialky obsahují dostatečné množství vzorku pro všechny nástřiky.

Příprava detektoru

• Zahřívejte lampu alespoň 1 h tak, aby byla zaručena základní stabilita.
• Pouze pro RI detektory (refraktometrické detektory): zapněte ohřev a propláchněte referenční stranu a stranu vzorku čerstvým rozpouštědlem, které se používá pro aktuální analýzu.

Ekvilibrace systému

• V době kdy se lampa detektoru zahřívá, stabilizujte systém (včetně kolony a detektoru) s nastavením parametrů analýz po dobu alespoň 15 min, dokud nebude stabilní tlak a signál základní linie detektoru.

Vypnutí systému

• Kolonu propláchněte příslušnými rozpouštědly a uložte podle pokynů v návodu k použití kolony (ujistěte se, že proplachovací rozpouštědlo je kompatibilní s rozpouštědlem obsaženým v systému, aby se zabránilo precipitaci).

• Instalujte spojku nebo restrikční kapiláru a důkladně propláchněte systém vodou, zejména po použití pufrů. Podrobnosti naleznete v dalších dílech.

• Systém propláchněte a konzervujte v 50 % methanolu nebo 50 % isopropanolu ve vodě bez přísad.

• Odeberte všechny vzorky z autosampleru a uložte je v souladu se správnou laboratorní praxí.

• Všechny moduly odpojte od zdroje napájení.

Výběr literatury na téma řešení problémů a údržba HPLC systému Agilent v knihovně LabRulezLCMS

• Preventive and Routine Maintenance for Your HPLC System (Prezentace | 2022)

• Get Your LC Back Up and Running After the Shut Down (Příručky | 2020)

• HPLC Troubleshooting Fundamentals (Prezentace | 2021)

• Top 10 HPLC Method Development Fails (Prezentace | 2022)

• Don’t Lose It: Troubleshooting Separation Changes (Prezentace | 2020)

• From HPLC Instrument to Column - Tracking Down the HPLC Problem (Prezentace | 2022)

• The Chromatography Checklist (Prezentace | 2018)

• Surviving Chromatography - Part 1: Preventive Action (Prezentace | 2019)

• Surviving Chromatography - Part 2: Corrective Action (Prezentace | 2018)

• LC Troubleshooting Guide - Your guide to solving common problems and staying productive (Postery | 2019)

• HPLC Column Troubleshooting: Is It Really The Column? (Prezentace | 2010)

• The Chromatography Detective: Troubleshooting Tips & Tools for LC & LCMS (Prezentace | 2018)

• All About LC Connections –What to Do to Make A Great One - HPLC educational webinar: Becoming a better chromatographer (Prezentace | 2021)

• It’s Not All About the Column: The Role of the Mobile Phase and Your Instrument (Prezentace | 2021)

• Tips and Tricks of HPLC System Troubleshooting (Prezentace | 2005)

• Maximize Performance and Minimize Maintenance with Genuine Agilent LC Spares (Technické články | 2015)

• Hydrophilic Interaction Chromatography Method Development and Troubleshooting (Technické články | 2018)

• Why Did That Happen? (Prezentace | 2021)

• Around the LC System in 45 Slides (Prezentace | 2016)

• Taking the Trouble Out of TroubleshootingIs It the Column, Method, or Instrument (Prezentace | 2016)