Základy HPLC (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie) | LabRulez LCMS

TEORIE, PRAXE A ÚDRŽBA: HPLC – Vysokoúčinná kapalinová chromatografie – základy a principy

Út, 1.12.2020
| Originální článek z: HPST/Jan Adamiec
Jedná se o separační a současně analytickou techniku, která slouží k oddělení jednotlivých složek vzorku na základě jejich povahy a k následné identifikaci a kvantifikaci.
Video placeholder

HPST: TEORIE, PRAXE A ÚDRŽBA: HPLC – Vysokoúčinná kapalinová chromatografie – základy a principy

Pro separaci se využívá distribuce látek mezi dvě fáze, mobilní/pohyblivou a stacionární/nepohyblivou.

Z hlediska fyzikálně-chemického principu dělení můžeme kapalinovu chromatografii rozdělit na:
  • adsorpční chromatografii - k separaci dochází v důsledku specifických interakcí látek se stacionární fází tvořenou pevnými, nemodifikovanými částicemi
  • rozdělovací chromatografii - látky jsou zachytávány v kapalné stacionární fázi, která je nanesená na pevném nosiči
  • iontově-výměnnou chromatografii - slouží k separaci iontů na stacionární fázi, kterým je nosič s navázanými nabitými funkčními skupinami
  • gelovou (permeační) chromatografii - kdy dochází k dělení látek na základě velikosti částic, které se zachytávájí ve stacionární fázi tvořené gelem s jasně definovanou velikostí pórů
  • afinitní chromatografii – která umožňuje oddělení příbuzných proteinů z komplexní směsi, na základě interakce s nosičem s imobilizovanými ligandy
  • speciální chromatografie – chirální aj.
Obecně se kapalinový chromatograf skládá z:
  • vysokotlakého čerpadla (pumpy) – slouží k transportu mobilní fáze
  • zařízení pro dávkování vzorku – automatické nebo manuální
  • chromatografické kolony (stacionární fáze) – ta může být v termostatovaném prostoru
  • detektoru - zaznamenává signál, který je dán rozdílem mezi průchodem čisté mobilní fáze a mobilní fází obsahující eluovanou složku (vzorek)
  • také může obsahovat řadu obměn – další detektor i pumpu, frakční kolektor, soustavu ventilů apod.

Smyslem tohoto článku je pak vysvětlit tok mobilní fáze systémem HPLC na jedné z nejčastěji používaných sestav Agilent Technologies.

Na Obrázku 1 můžete vidět schéma, kde mobilní fáze prochází kvartérní pumpou, jejíž součástí je degasser pro její odplynění a která umožňuje míchání až čtyř různých rozpouštědel. K tomuto nízkotlakému míchání dochází ve směšovacím ventilu (MCGV - multi channel gradient valve), následně pak mobilní fáze proudí do vstupního ventilu před prvním pístem pumpy. Tento ventil může být řízen elektronicky (AIV - active inlet valve) a nebo pohybem pístu (PIV – passive inlet valve). Prvním pístem je pak mobilní fáze tlačena do výstupního ventilu (outlet valve) a na tlumič rázů (damper), jehož součástí je i tlakový senzor. Přes druhý píst proudí mobilní fáze do promývacího ventilu (purge valve), který ji pouští buď do odpadu a promývá se pouze pumpa a nebo dál do zbytku sestavy.

HPST: Obrázek 1 Schéma toku mobilní fáze kapalinovým chromatografem s UV detekcí

Pokud je promývací ventil zavřený, jde mobilní fáze kapilárou do dávkovacího ventilu autosampleru. Nedochází-li v dané chvíli k nástřiku vzorku, proudí tato fáze skrz dávkovací zařízení, smyčku, jehlu a sedýlko zpět do dávkovacího ventilu. To je hlavní výhoda automatických samplerů firmy Agilent Technologies, že vnitřní části, potřebné pro nadávkování vzorku, jsou neustále promývány mobilní fází a tím se snižuje možnost přenosu analytů z jednoho vzorku do druhého.

Z autosampleru proudí mobilní fáze na chromatografickou kolonu, kde po nadávkování vzorku dochází k separaci jednotlivých složek vzorku, které jsou dále unášeny do detektoru diodového pole (DAD).

Detekce těchto složek v DAD je pak dána absorbancí paprsku světla konkrétní vlnové délky při průchodu analytickou celou, kterou také prochází mobilní fáze. V chromatografickém softwaru pak můžeme rozdíl mezi absorbancí čisté mobilní fáze a absorbancí mobilní fáze s odseparovanou složkou vzorku pozorovat jako chromatogram. Z cely detektoru odchází mobilní fáze do odpadu, případně do frakčního kolektoru či dalšího detektoru.

Správné pochopení toku mobilní fáze pak může uživatelům usnadnit diagnostiku problému, který se může projevit nestandardněm vysokým nebo naopak nízkým zpětným tlakem v systému HPLC. Tento tlak je kontinuálně monitorován tlakovým senzorem a může být sledován v chromatografickém softwaru.

Příští díl servisního okénka HPLC by měl být věnován jednotlivým typům HPLC/UHPLC pump, které na náš trh dodává společnost Agilent Technologies.

Přehled literatury k základům a principům v plynové chromatografii od Agilent Technologies (ke stažení v knihovně LabRulezGCMS)

  • HPLC Separation Fundamentals - LC Columns and Consumables (Prezentace | 2007)

  • HPLC Troubleshooting Fundamentals (Prezentace | 2021)

  • Mass Spectrometry Fundamentals –Theory (Prezentace | 2016)

  • SAMPLE PREPARATION FUNDAMENTALS FOR CHROMATOGRAPHY (Příručky | 2013)

  • Eliminate your Application and Chromatography Challenges - Optimizing your Application/Method Transfer considerations (Prezentace | 2020)

  • Eliminate your Application and Chromatography Challenges - Troubleshooting your Method, Application/Chromatography (Prezentace | 2020)

  • Is 2D HPLC the Answer for You (Prezentace | 2021)

  • Demystifying the Chromatographic Process (Prezentace | 2014)

  • HPLC Method Development Systematic Approach vs Random Walk - Improving the Efficiency of Method Development and Optimization (Prezentace | 2014)

  • Can I Really Enjoy the Benefits of the Latest LC Column Technology? (Prezentace | 2016)

HPST
 

Mohlo by Vás zajímat

Overcoming the challenges of liquid chromatography method transfer: A CDMO perspective

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---

Method for the determination of 431 Residual Pesticides in Honey using LCMS-8050 and GCMS-TQ8040 NX

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

ASMS: IMPROVEMENTS IN SENSITIVITY, QUANTITATIVE LINEARITY, AND ROBUSTNESS USING A MODIFIED BENCH-TOP QUADRUPOLE ORTHOGONAL TIME-OF-FLIGHT MASS SPECTROMETER (Q-TOF MS)

Postery
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
---

Determination of Per and Polyfluoroalkyl Substances in Soils Using Carbon S SPE by LC/MS/MS

Aplikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
Příprava vzorků, Spotřební materiál, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

ASTM D4327-03 Compliant Analysis of Anions in Wastewater

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Vědecký článek | Potraviny

Analytické metody stanovení polyfenolů ve sladinách, mladinách a pivech

Pro stanovení jednotlivých polyfenolů je nejrozšířenější metodou HPLC na reverzní fázi s různými druhy detekce. Méně rozšířená je metoda GC ve spojení s MS detekcí, a to kvůli derivatizaci analytu.
Článek | Video

Základy vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) - PUMPY A GRADIENT

V sérii dílu o základech a principech v kapalinové chromatografii se podíváme na jednotlivé komponenty HPLC systémů. V první části si připomeneme základní rozdělení a funkce pump a jimi poskytovaných gradientů.
Článek | Akademie

Průvodce řešením problémů v HPLC - Retenční čas, Rozlišení, Citlivost, Drift a Šum

Třetí díl seriálu o tzv. troubleshootingu v HPLC se podívá na postupy v případě výskytu fluktuace retenčních časů, ztráty rozlišení, změny citlivosti, driftu základní linie nebo šumu základní linie.
 

Mohlo by Vás zajímat

Overcoming the challenges of liquid chromatography method transfer: A CDMO perspective

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---

Method for the determination of 431 Residual Pesticides in Honey using LCMS-8050 and GCMS-TQ8040 NX

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

ASMS: IMPROVEMENTS IN SENSITIVITY, QUANTITATIVE LINEARITY, AND ROBUSTNESS USING A MODIFIED BENCH-TOP QUADRUPOLE ORTHOGONAL TIME-OF-FLIGHT MASS SPECTROMETER (Q-TOF MS)

Postery
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
---

Determination of Per and Polyfluoroalkyl Substances in Soils Using Carbon S SPE by LC/MS/MS

Aplikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
Příprava vzorků, Spotřební materiál, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

ASTM D4327-03 Compliant Analysis of Anions in Wastewater

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Vědecký článek | Potraviny

Analytické metody stanovení polyfenolů ve sladinách, mladinách a pivech

Pro stanovení jednotlivých polyfenolů je nejrozšířenější metodou HPLC na reverzní fázi s různými druhy detekce. Méně rozšířená je metoda GC ve spojení s MS detekcí, a to kvůli derivatizaci analytu.
Článek | Video

Základy vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) - PUMPY A GRADIENT

V sérii dílu o základech a principech v kapalinové chromatografii se podíváme na jednotlivé komponenty HPLC systémů. V první části si připomeneme základní rozdělení a funkce pump a jimi poskytovaných gradientů.
Článek | Akademie

Průvodce řešením problémů v HPLC - Retenční čas, Rozlišení, Citlivost, Drift a Šum

Třetí díl seriálu o tzv. troubleshootingu v HPLC se podívá na postupy v případě výskytu fluktuace retenčních časů, ztráty rozlišení, změny citlivosti, driftu základní linie nebo šumu základní linie.
 

Mohlo by Vás zajímat

Overcoming the challenges of liquid chromatography method transfer: A CDMO perspective

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---

Method for the determination of 431 Residual Pesticides in Honey using LCMS-8050 and GCMS-TQ8040 NX

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

ASMS: IMPROVEMENTS IN SENSITIVITY, QUANTITATIVE LINEARITY, AND ROBUSTNESS USING A MODIFIED BENCH-TOP QUADRUPOLE ORTHOGONAL TIME-OF-FLIGHT MASS SPECTROMETER (Q-TOF MS)

Postery
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
---

Determination of Per and Polyfluoroalkyl Substances in Soils Using Carbon S SPE by LC/MS/MS

Aplikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
Příprava vzorků, Spotřební materiál, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

ASTM D4327-03 Compliant Analysis of Anions in Wastewater

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Vědecký článek | Potraviny

Analytické metody stanovení polyfenolů ve sladinách, mladinách a pivech

Pro stanovení jednotlivých polyfenolů je nejrozšířenější metodou HPLC na reverzní fázi s různými druhy detekce. Méně rozšířená je metoda GC ve spojení s MS detekcí, a to kvůli derivatizaci analytu.
Článek | Video

Základy vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) - PUMPY A GRADIENT

V sérii dílu o základech a principech v kapalinové chromatografii se podíváme na jednotlivé komponenty HPLC systémů. V první části si připomeneme základní rozdělení a funkce pump a jimi poskytovaných gradientů.
Článek | Akademie

Průvodce řešením problémů v HPLC - Retenční čas, Rozlišení, Citlivost, Drift a Šum

Třetí díl seriálu o tzv. troubleshootingu v HPLC se podívá na postupy v případě výskytu fluktuace retenčních časů, ztráty rozlišení, změny citlivosti, driftu základní linie nebo šumu základní linie.
 

Mohlo by Vás zajímat

Overcoming the challenges of liquid chromatography method transfer: A CDMO perspective

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---

Method for the determination of 431 Residual Pesticides in Honey using LCMS-8050 and GCMS-TQ8040 NX

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

ASMS: IMPROVEMENTS IN SENSITIVITY, QUANTITATIVE LINEARITY, AND ROBUSTNESS USING A MODIFIED BENCH-TOP QUADRUPOLE ORTHOGONAL TIME-OF-FLIGHT MASS SPECTROMETER (Q-TOF MS)

Postery
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
---

Determination of Per and Polyfluoroalkyl Substances in Soils Using Carbon S SPE by LC/MS/MS

Aplikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
Příprava vzorků, Spotřební materiál, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

ASTM D4327-03 Compliant Analysis of Anions in Wastewater

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Vědecký článek | Potraviny

Analytické metody stanovení polyfenolů ve sladinách, mladinách a pivech

Pro stanovení jednotlivých polyfenolů je nejrozšířenější metodou HPLC na reverzní fázi s různými druhy detekce. Méně rozšířená je metoda GC ve spojení s MS detekcí, a to kvůli derivatizaci analytu.
Článek | Video

Základy vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) - PUMPY A GRADIENT

V sérii dílu o základech a principech v kapalinové chromatografii se podíváme na jednotlivé komponenty HPLC systémů. V první části si připomeneme základní rozdělení a funkce pump a jimi poskytovaných gradientů.
Článek | Akademie

Průvodce řešením problémů v HPLC - Retenční čas, Rozlišení, Citlivost, Drift a Šum

Třetí díl seriálu o tzv. troubleshootingu v HPLC se podívá na postupy v případě výskytu fluktuace retenčních časů, ztráty rozlišení, změny citlivosti, driftu základní linie nebo šumu základní linie.
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití

LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena.