Základy HPLC (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie) | LabRulez LCMS

TEORIE, PRAXE A ÚDRŽBA: HPLC – Vysokoúčinná kapalinová chromatografie – základy a principy

Út, 1.12.2020
| Originální článek z: HPST/Jan Adamiec
Jedná se o separační a současně analytickou techniku, která slouží k oddělení jednotlivých složek vzorku na základě jejich povahy a k následné identifikaci a kvantifikaci.
Video placeholder

HPST: TEORIE, PRAXE A ÚDRŽBA: HPLC – Vysokoúčinná kapalinová chromatografie – základy a principy

Pro separaci se využívá distribuce látek mezi dvě fáze, mobilní/pohyblivou a stacionární/nepohyblivou.

Z hlediska fyzikálně-chemického principu dělení můžeme kapalinovu chromatografii rozdělit na:
  • adsorpční chromatografii - k separaci dochází v důsledku specifických interakcí látek se stacionární fází tvořenou pevnými, nemodifikovanými částicemi
  • rozdělovací chromatografii - látky jsou zachytávány v kapalné stacionární fázi, která je nanesená na pevném nosiči
  • iontově-výměnnou chromatografii - slouží k separaci iontů na stacionární fázi, kterým je nosič s navázanými nabitými funkčními skupinami
  • gelovou (permeační) chromatografii - kdy dochází k dělení látek na základě velikosti částic, které se zachytávájí ve stacionární fázi tvořené gelem s jasně definovanou velikostí pórů
  • afinitní chromatografii – která umožňuje oddělení příbuzných proteinů z komplexní směsi, na základě interakce s nosičem s imobilizovanými ligandy
  • speciální chromatografiechirální aj.

+ 20 zdarma dostupných webinářů Agilent Technologies na téma akademie a principy HPLC v databázi

School Series of LC Basic Chapter
School Series of LC Advanced Chapter
  • Současné trendy ve vývoji HPLC metod
  • Systematické přístupy
  • Jak začít s vývojem HPLC metody
  • Služby pro celou laboratoř
  • Pokročilé tipy a triky pro odstraňování problémů
  • Vliv parametrů pokročilých metod v HPLC
  • Klíčové unikátní vlastnosti UHPLC systémů
Obecně se kapalinový chromatograf skládá z:
  • vysokotlakého čerpadla (pumpy) – slouží k transportu mobilní fáze
  • zařízení pro dávkování vzorku – automatické nebo manuální
  • chromatografické kolony (stacionární fáze) – ta může být v termostatovaném prostoru
  • detektoru - zaznamenává signál, který je dán rozdílem mezi průchodem čisté mobilní fáze a mobilní fází obsahující eluovanou složku (vzorek)
  • také může obsahovat řadu obměn – další detektor i pumpu, frakční kolektor, soustavu ventilů apod.

Smyslem tohoto článku je pak vysvětlit tok mobilní fáze systémem HPLC na jedné z nejčastěji používaných sestav Agilent Technologies.

Na Obrázku 1 můžete vidět schéma, kde mobilní fáze prochází kvartérní pumpou, jejíž součástí je degasser pro její odplynění a která umožňuje míchání až čtyř různých rozpouštědel. K tomuto nízkotlakému míchání dochází ve směšovacím ventilu (MCGV - multi channel gradient valve), následně pak mobilní fáze proudí do vstupního ventilu před prvním pístem pumpy.

Tento ventil může být řízen elektronicky (AIV - active inlet valve) a nebo pohybem pístu (PIV – passive inlet valve). Prvním pístem je pak mobilní fáze tlačena do výstupního ventilu (outlet valve) a na tlumič rázů (damper), jehož součástí je i tlakový senzor. Přes druhý píst proudí mobilní fáze do promývacího ventilu (purge valve), který ji pouští buď do odpadu a promývá se pouze pumpa a nebo dál do zbytku sestavy.

HPST: Obrázek 1 Schéma toku mobilní fáze kapalinovým chromatografem s UV detekcí

Pokud je promývací ventil zavřený, jde mobilní fáze kapilárou do dávkovacího ventilu autosampleru. Nedochází-li v dané chvíli k nástřiku vzorku, proudí tato fáze skrz dávkovací zařízení, smyčku, jehlu a sedýlko zpět do dávkovacího ventilu. To je hlavní výhoda automatických samplerů firmy Agilent Technologies, že vnitřní části, potřebné pro nadávkování vzorku, jsou neustále promývány mobilní fází a tím se snižuje možnost přenosu analytů z jednoho vzorku do druhého.

Z autosampleru proudí mobilní fáze na chromatografickou kolonu, kde po nadávkování vzorku dochází k separaci jednotlivých složek vzorku, které jsou dále unášeny do detektoru diodového pole (DAD).

Detekce těchto složek v DAD je pak dána absorbancí paprsku světla konkrétní vlnové délky při průchodu analytickou celou, kterou také prochází mobilní fáze.

V chromatografickém softwaru pak můžeme rozdíl mezi absorbancí čisté mobilní fáze a absorbancí mobilní fáze s odseparovanou složkou vzorku pozorovat jako chromatogram. Z cely detektoru odchází mobilní fáze do odpadu, případně do frakčního kolektoru či dalšího detektoru.

Správné pochopení toku mobilní fáze pak může uživatelům usnadnit diagnostiku problému, který se může projevit nestandardněm vysokým nebo naopak nízkým zpětným tlakem v HPLC systému. Tento tlak je kontinuálně monitorován tlakovým senzorem a může být sledován v chromatografickém softwaru.

Příští díl servisního okénka HPLC by měl být věnován jednotlivým typům HPLC/UHPLC pump, které na náš trh dodává společnost Agilent Technologies.

Přehled literatury k základům a principům v kapalinové chromatografii od Agilent Technologies (ke stažení v knihovně LabRulezLCMS)

  • HPLC Separation Fundamentals - LC Columns and Consumables (Prezentace | 2007)

  • HPLC Troubleshooting Fundamentals (Prezentace | 2021)

  • Mass Spectrometry Fundamentals –Theory (Prezentace | 2016)

  • SAMPLE PREPARATION FUNDAMENTALS FOR CHROMATOGRAPHY (Příručky | 2013)

  • Eliminate your Application and Chromatography Challenges - Optimizing your Application/Method Transfer considerations (Prezentace | 2020)

  • Eliminate your Application and Chromatography Challenges - Troubleshooting your Method, Application/Chromatography (Prezentace | 2020)

  • Is 2D HPLC the Answer for You (Prezentace | 2021)

  • Demystifying the Chromatographic Process (Prezentace | 2014)

  • HPLC Method Development Systematic Approach vs Random Walk - Improving the Efficiency of Method Development and Optimization (Prezentace | 2014)

  • Can I Really Enjoy the Benefits of the Latest LC Column Technology? (Prezentace | 2016)

HPST
 

Mohlo by Vás zajímat

Determination of tetrafluoroborate, perchlorate, and hexafluorophosphate in an electrolyte sample for lithium-ion battery production

Aplikace
| 2023 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Průmysl a chemie

Exploring the Impact of Part Per Billion Mass Accuracy for Metabolite Identification Using Multi Reflecting Time-of-Flight MS With UPLC™ Part A

Aplikace
| 2023 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
Metabolomika

Peptide Mapping at Elevated Temperatures

Aplikace
| 2023 | Agilent Technologies
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

Improved Peak Shape and Lower LOQs in Pesticide Analysis

Aplikace
| 2023 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

PFAS Methods – Standardized

Ostatní
| 2023 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Článek | Video

Základy vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) - PUMPY A GRADIENT

V sérii dílu o základech a principech v kapalinové chromatografii se podíváme na jednotlivé komponenty HPLC systémů. V první části si připomeneme základní rozdělení a funkce pump a jimi poskytovaných gradientů.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Separace na reverzních fázích

Separace na reverzních fázích je základem kapalinové chromatografie. Jak ji používat v extrémních oblastech pH, jak zvýšit retenci polárních látek a jaký vliv mají aktivity zbytkových silanolových skupin?
Přednáška | Video

Předcházejte problémům v HPLC s využitím příslušenství Agilent

Záznam přednášky Andrey Vernerové z letošního HPST semináře Novinky a trendy (nejen) Agilent Technologies na téma prevence, diagnostiky a řešení problémů v HPLC (Troubleshooting).
 

Mohlo by Vás zajímat

Determination of tetrafluoroborate, perchlorate, and hexafluorophosphate in an electrolyte sample for lithium-ion battery production

Aplikace
| 2023 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Průmysl a chemie

Exploring the Impact of Part Per Billion Mass Accuracy for Metabolite Identification Using Multi Reflecting Time-of-Flight MS With UPLC™ Part A

Aplikace
| 2023 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
Metabolomika

Peptide Mapping at Elevated Temperatures

Aplikace
| 2023 | Agilent Technologies
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

Improved Peak Shape and Lower LOQs in Pesticide Analysis

Aplikace
| 2023 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

PFAS Methods – Standardized

Ostatní
| 2023 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Článek | Video

Základy vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) - PUMPY A GRADIENT

V sérii dílu o základech a principech v kapalinové chromatografii se podíváme na jednotlivé komponenty HPLC systémů. V první části si připomeneme základní rozdělení a funkce pump a jimi poskytovaných gradientů.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Separace na reverzních fázích

Separace na reverzních fázích je základem kapalinové chromatografie. Jak ji používat v extrémních oblastech pH, jak zvýšit retenci polárních látek a jaký vliv mají aktivity zbytkových silanolových skupin?
Přednáška | Video

Předcházejte problémům v HPLC s využitím příslušenství Agilent

Záznam přednášky Andrey Vernerové z letošního HPST semináře Novinky a trendy (nejen) Agilent Technologies na téma prevence, diagnostiky a řešení problémů v HPLC (Troubleshooting).
 

Mohlo by Vás zajímat

Determination of tetrafluoroborate, perchlorate, and hexafluorophosphate in an electrolyte sample for lithium-ion battery production

Aplikace
| 2023 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Průmysl a chemie

Exploring the Impact of Part Per Billion Mass Accuracy for Metabolite Identification Using Multi Reflecting Time-of-Flight MS With UPLC™ Part A

Aplikace
| 2023 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
Metabolomika

Peptide Mapping at Elevated Temperatures

Aplikace
| 2023 | Agilent Technologies
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

Improved Peak Shape and Lower LOQs in Pesticide Analysis

Aplikace
| 2023 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

PFAS Methods – Standardized

Ostatní
| 2023 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Článek | Video

Základy vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) - PUMPY A GRADIENT

V sérii dílu o základech a principech v kapalinové chromatografii se podíváme na jednotlivé komponenty HPLC systémů. V první části si připomeneme základní rozdělení a funkce pump a jimi poskytovaných gradientů.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Separace na reverzních fázích

Separace na reverzních fázích je základem kapalinové chromatografie. Jak ji používat v extrémních oblastech pH, jak zvýšit retenci polárních látek a jaký vliv mají aktivity zbytkových silanolových skupin?
Přednáška | Video

Předcházejte problémům v HPLC s využitím příslušenství Agilent

Záznam přednášky Andrey Vernerové z letošního HPST semináře Novinky a trendy (nejen) Agilent Technologies na téma prevence, diagnostiky a řešení problémů v HPLC (Troubleshooting).
 

Mohlo by Vás zajímat

Determination of tetrafluoroborate, perchlorate, and hexafluorophosphate in an electrolyte sample for lithium-ion battery production

Aplikace
| 2023 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Průmysl a chemie

Exploring the Impact of Part Per Billion Mass Accuracy for Metabolite Identification Using Multi Reflecting Time-of-Flight MS With UPLC™ Part A

Aplikace
| 2023 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
Metabolomika

Peptide Mapping at Elevated Temperatures

Aplikace
| 2023 | Agilent Technologies
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

Improved Peak Shape and Lower LOQs in Pesticide Analysis

Aplikace
| 2023 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

PFAS Methods – Standardized

Ostatní
| 2023 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Článek | Video

Základy vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) - PUMPY A GRADIENT

V sérii dílu o základech a principech v kapalinové chromatografii se podíváme na jednotlivé komponenty HPLC systémů. V první části si připomeneme základní rozdělení a funkce pump a jimi poskytovaných gradientů.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Separace na reverzních fázích

Separace na reverzních fázích je základem kapalinové chromatografie. Jak ji používat v extrémních oblastech pH, jak zvýšit retenci polárních látek a jaký vliv mají aktivity zbytkových silanolových skupin?
Přednáška | Video

Předcházejte problémům v HPLC s využitím příslušenství Agilent

Záznam přednášky Andrey Vernerové z letošního HPST semináře Novinky a trendy (nejen) Agilent Technologies na téma prevence, diagnostiky a řešení problémů v HPLC (Troubleshooting).
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití

LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena.