Předcházejte problémům v HPLC s využitím příslušenství Agilent

Při výskytu problému a jeho diagnostice bychom si měli uvědomit, že příčinu můžeme nalézt, jak v přípravě vzorku, v našem LC systému, kde každá část může být potenciálním zdrojem problémů nebo také v našem detektoru, ať už se jedná o konvenční detektory, tak o tandemové hmotnostní spektrometry.

HPST: Možné potenciální zdroje problémů v HPLC nebo LC/MS analýze

HPLC systém – problémy hardware

Jaké jsou tedy nejčastější problémy, které jsou způsobeny poruchou či opotřebením hardwaru?

• Pumpa: ↑/↓/ kolísavý tlak systému – netěsnost v systému, neprůchozí ventilky pumpy, poškozené písty nebo jejich těsnění, nefunkční degaser, nevhodný oplach pístů, zablokovaná kapilára

• Autosampler: Neopakovatelné dávkování, přenos vzorku, změna plochy píku – netěsnost sytému, ohnutá/zablokovaná jehla či sedýlko, nesprávně naplněná vialka, nevhodná oplachová kapalina

• Termostat kolon: ↑/↓/ kolísavý retenční čas, vliv na tvar píku a tlak systému – netěsnost sytému, zablokovaná kolona, zablokované/olámané systémové kapiláry, opotřebená ferule

• Detektor: Uřezaný pík, negativní píky, snížení účinnosti, necyklický průběh základní linie – prasklá/znečištěná cela detektoru, přítomnost vzduchové bublinky, netěsnost systému, prach v modulu (nedostatečný ohřev/chlazení)

• Mobilní fáze: Vliv na všechny části LC systému – kontaminace

HPST: HPLC systém – problémy hardware můžou pocházet z HPLC pumpy, autosampleru, termostatu kolon, detektoru nebo např. mobilní fáze

Preventivní prohlídky - pravidelný servis

Jak můžeme eliminovat problémy v našem HPLC systému? Důležitá je pravidelná kontrola všech části systému, a to minimálně 1 x ročně a případná výměna opotřebených dílů. Tuto kontrolu si můžeme provést každý uživatel sám, avšak musí mít správné náhradní díly, nebo ji může provést servisní technik v rámci pravidelných preventivních prohlídek, kde má technik jasně dané procedury, které musí zkontrolovat a které díly případně vyměnit.

1x ročně zajišťuje servisní technik

HPLC pumpa:

• výměna těsnění

Autosampler:

• výměna rotor sealu v nástřikovém ventilu
• Výměna těsnění v nástřikové hlavě
• Výměna jehly a sedýlka

…a další dle stavu přístroje a požadavku zákazníka

Na závěr zkouška těsnosti celé sestavy.

Na obrázcích níže jsou ukázány opotřebené či zanesené díly, které jsou měněny a mohou způsobovat problémy ve vašem systému.

HPST: Opotřebení části HPLC systému jako jsou frity purge ventilu, rezavé části hlavy pumpy nebo vysolená mobilní fáze v nástřikové hlavě

LC systém - prevence - uživatel

Nicméně předcházet problémům, můžeme také my uživatelé, a to zejména přípravou čisté mobilní fáze, vhodnou úpravou vzorku a také ochránit kolonu a prodloužit její životnost.

• Chemie mobilní fáze (čistota, pH, koncentrace)

• Ochrana chromatografické kolony – prodloužení její životnosti

• Vhodná příprava vzorku před analýzou, vhodné vialky se septy

💡💡💡 Přehled literatury HPLC a LCMS Troubleshooting od Agilent Technologies ke stažení

LC systém - prevence - Mobilní fáze

Důležitá je zejména kvalita a čistota HPLC mobilní fáze. Při použití vodných fází a zejména fosfátových pufrů je důležitá příprava vždy čerstvé fáze, její filtrace a uchování v tmavých láhvích jako prevence bakteriální kontaminace.

Použití vhodných bezpečnostních uzávěrů jako prevence kontaminace z prostředí laboratoře (prachové částice) a také naopak zamezí to úniku par do prostředí laboratoře.

S mobilní fázi také souvisí pravidelná kontrola frit, které mohou být olámané nebo znečištění a brání vstupu mobilní fáze do systému a kontaminují ho. Skleněné frity mají tu výhodu oproti nerezovým, že lze čistit ultrazvukováním v metanolu nebo v kyselině dusičné.

• Kvalita a čistota mobilní fáze: HPLC grade, LC-MS grade a další

• Vodné mobilní fáze: filtrace (0,2 nebo 0,45 μm), tmavé láhve, vždy čerstvé

• Vhodné bezpečnostní uzávěry: prevence kontaminace, úniku par rozpouštědla

• Pravidelná kontrola frit v zásobních láhvích (olámané nebo znečištěné) – bakteriální kontaminace a následná neprůchodnost

HPST: HPLC systém - prevence - Mobilní fáze

Proč je důležité používat rozpouštědlo určité čistoty? Kvalita mobilní fáze má především vliv na šum a drift základní linie. To je důležité, když pracujeme v oblasti blízké UV cut-off hodnotě mobilní fáze. Na trhu existuje celá řada typů methanolu.

Na obrázku níže můžete vidět specifikace pro Methanol HPLC, LCMS a HPLC Plus a při porovnání jejich maximálních absorbancí při 260 nm jsou vidět jejich významné odlišnosti.

HPST: Srovnání různých kvalitatiních tříd HPLC rozpouštědla Methanol

InfinityLab Stay Safe promývací láhev

V rámci prevence kontaminace mobilní fáze a úniku par z rozpouštědla, nabízí Agilent promývací láhev se čtyřmi hrdly, která slouží k umístění nepoužívaných hadiček pro přívod mobilní fáze. V běžném režimu používáme jednu láhev, která je naplněna organickým rozpouštedlem pro promytí našeho LC systému a do té láhve přivedeme všechny hadičky.

Avšak pokud necháme láhev otevřenou po delší čas může se mobilní fáze kontaminovat prachovými částicemi z prostředí a zároveň také dochází k úniku nežádoucích par do prostředí laboratoře. Navíc se mohou hadičky s fritami různě překrucovat a vyklouzávat z láhve. V případě použití promývací lahve Agilent InfinityLab Stay Safe můžeme všechny zmíněné problémy eliminovat.

Pomocí šroubení můžeme upevnit hadičky v přesně dané poloze, aby nedocházelo k překroucení. Můžeme také omezit křížovou kontaminaci rozpouštědel. S prevencí kontaminace také souvisejí bezpečnostní víčka.

HPST: InfinityLab Stay Safe promývací láhev

InfinityLab Stay Safe bezpečnostní víčka

Bezpečnostní víčka jsou opatřená filtry, které chrání rozpouštědla před kontaminací z prostředí a zabraňují úniku par z láhve. Filtr je také opatřený časovým pásem, který signalizuje jeho nasycení a nutnou výměnu. Máme k dispozici filtry jak na víčko mobilní fáze, tak na víčko od odpadní lahve, které je naplněno aktivním uhlím, aby vychytávalo nebezpečné páry.

Je nutné si uvědomit, že šroubení pevně uchytí hadičky ve stanovené poloze a víčka není vhodné dotahovat úplně pro plynulé nasávání mobilní fázi do systému.

• Rozdílný počet výstupů dle požadavků uživatele

• Filtrační membrána: Ochrana solventů před prachem a dalšími možnými kontaminacemi z prostředí.

• Jednocestný ventil: Prevence úniku nebezpečných výparů z láhve.

• 6ti měsíční časový pás

• Signalizace výměny

HPST: InfinityLab Stay Safe bezpečnostní víčka

Na obrázku níže je ukázána procentuální ztráta methanolu odpařováním při použití různých uzávěrů a čistě otevřené láhve. Ztráta methanolu byla pozorována v čase během 30 dnů a z grafu i tabulky je patrné, že došlo ke ztrátě 85% methanolu při porovnání standardního víčka a bezpečnostního víčka a 98% pokles při porovnání otevřené láhve s použitím bezpečnostního víčka.

HPST: Ztráta methanolu odpařováním při použití různých uzavěrů na lahvích s rozpouštědly

LC systém - prevence - Autosampler

U autosampleru můžeme předcházet problémům správným nastavením pozice jehly, aby nedocházelo k poškození vialky následnému znehodnocení vzorku a zablokování nebo ohnutí jehly. Dále správnou volbou oplachové kapaliny, použitím kvalitních sept a zejména vhodnou úpravou vzorku před analýzou.

• Správně nastavit needle offset (bottom sensing) – vialsampler x multisampler

• Správná volba oplachové kapaliny (10-15% IPA, flush port x vialky)

• Používat kvalitní septa – při opakovaném nástřiku kontaminace vzorku

• Vhodná úprava vzorku

Captiva EMR-Lipid

Jedním z dalších typů pro prevenci kontaminace systému je filtrace vzorku. Nejenom proteiny mohou negativně ovlivňovat separaci našich látek, ale mohou to být také lipidy, které jsou obsažené v matrici vzorku.

Právě pro selektivní odstranění lipidů slouží filtry z produktové řady Captiva EMR lipid, které minimálně potlačují ionty cílových analytů, a tím zvyšují spolehlivost a robustnost metody.

Filtrace vzorku před analýzou

• Vysoce selektivní a účinné odstranění lipidů/matrice bez ztráty analytu

• Minimální potlačení iontů cílových analytů → vyšší spolehlivost a robustnost metody

• ↑ citlivost analytů, zlepšení tvaru píku a prodloužení životnosti kolony

• 3 v 1: precipitace proteinů, filtrace a selektivní odstranění lipidů

2 formáty:

• Kolonky 1 ml (biologické matrice), 3 a 6 ml (QuEchERS)
• 96ti jamkové destičky

HPST: Captiva EMR-Lipid - Vylepšené odstranění matrice (Enhanced Matrix Removal, EMR)

Vylepšené odstranění matrice (Enhanced Matrix Removal, EMR)

• Speciálně navržený k odstranění tuků a lipidů z různých matric

EMR technologie sorbentu účinně zachycuje lipidy pomocí dvou mechanismů:

• Vylučovací selekce - nerozvětvené uhlovodíkové řetězce (lipidy) vstupují do sorbentu, objemné analyty nikoliv
• Chemie sorbentu - lipidové řetězce vstupující do sorbentu jsou zachyceny hydrofobní interakcí

Využití Captiva EMR-Lipid

1 ml kolonky a 96ti jamkové mikrotitrační destičky

• Biologické matrice – plazma, sérum

1ml kolonky a 96 jamkové destičky mají využití zejména pro biologické matrice, kde je do kolonky vložen vzorek poté rozpouštědlo, vše je smícháno a poté filtrováno bud přes vakuový manifold nebo positivním tlakem například přes injekční stříkačku. Poté dochází k naředění vzorku a přenesení do kolonky, které jsou následně filtrovány.

3 a 6 ml kolonky

• Potravinové matrice – ↑ obsah rostlinného/živočišného tuku

Obdobně jsou využity také 3 a 6 ml kolonky, které se používají zejména pro potravinové matrice po přečištění QuEchers.

HPST: Využití kolonek Captiva EMR-Lipid pro úpravu vzorků

Přečištění vzorků obsahujících tuk → ↑ odezva, ↓ RSD

Ukázka aplikace filtru EMR lipid pro přečištění vzorku séra pro stanovení 25 hydroxy metabolitů vitaminu D2 a D3. Z grafu je patrné, že po vhodné úpravě vzorků došlo ke zvýšení odezvy a ke snížení RSD tím pádem k lepší reprodukovatelnosti dat.

HPST: Použití kolonek Captiva EMR-Lipid pro přečištění vzorku séra pro stanovení 25 hydroxy metabolitů vitaminu D2 a D3

Captiva produkty pro běžnou filtraci

Captiva produkty slouží také k běžné filtraci vzorku přes stříkačkové filtry, které se vyrábějí ve dvojí kvalitě. Econo a Premium, které mají navíc ještě jeden pre-filtr pro důkladné přečištění.

V případě pokud máme málo vzorku pro analýzu je výhodné použít filtrační vialky, kde nedochází ke ztrátám vzorku a k dalšímu naředění. Existuje také celá řada typů membrán, kterou si můžete selektivně zvolit pro vaše cílové analyty.

• Vylepšený design filtru
• Snadnější průchod vzorku pomocí vakua nebo přetlaku

Různé formáty pro různé objemy:

Stříkačkové filtry

• 0,45 a 0,20 μm (možnost také 0,7 μm)
• Zpracování až 150 ml vzorku (4, 15, 25, 28 mm průměr)
• 2 typy: Econo a Premium

Filtrační vialky

• 0,45 a 0,20 μm
• Různé typy membrán: nylon, regenerovaná celulóza, polytetra-fluorethylen, polyethersulfon

HPST: Captiva produkty pro běžnou filtraci

LC systém - prevence - Kolona

Níže se podíváme na prevenci problémů v kolonovém termostatu a prodloužení životnosti kolony. Důležité je použití správného fittingu, Agilent má k dispozici dva fittingy Quick Connect a Quick Turn, která jsou odolné až do 1300 baru.

Důležitá je také pravidelná kontrola ferule, která je sice průtočná, takže na ní nevznikají drážky ze šroubení kolony, ale hrdlo ferule může být časem opotřebeno a je potřeba ho vyměnit.

Životnost kolony prodlužují zejména předkolony a prefiltry a také in-line filtry, které jsou zapojené před chromatografickou kolonu za nástřikový ventil.

• Použití správného fittingu (InfinityLab Quick Connect/Turn) – ↓ mrtvý objem, carry-over

• Pravidelná výměna kapilár, ferule, šroubů z materiálu PEEK (spotřební materiál)

• Předkolony/prefiltry – prodloužení životnosti kolony

• In-line filtry

HPST: HPLC systém - prevence - kolona - předkolony - fittingy

Agilent InfinityLab Quick Change in-line filtr

Agilent nabízí nový systém in-line filtru Quick Change, který významně prodlužuje životnost kolony, tím že vychytává nečistoty před vstupem do kolony. Oproti běžným filtrům můžeme provést výměnu častěji a bez jakéhokoliv podtékání a jeho tlaková odolnost je také do 1300 barů.

• Vychytává drobné nečistoty před vstupem do kolony

• Významné prodloužení životnosti kolony nebo předkolony

• Oproti běžným filtrům můžete provést až 100 výměn filtru bez netěsností

• Tlaková odolnost 1300 bar

HPST - Agilent InfinityLab Quick Change in-line filtr.jpg

Výhody použití

• Snadné manuální dotažení při výměně filtračního disku (bez rizika podtékaní z nedostatečného utažení)

• Bezdotyková výměna filtračních disků pro minimalizaci kontaminace

• Široký výběr rozměrů a velikosti porozity filtračních disků pro každý HPLC systém

HPST: Agilent InfinityLab Quick Change in-line filtr - výhody a použití

HPLC Advisor

HPLC Advisor je nová aplikace, která vyšla v květnu tohoto roku. Tato slouží aplikace zejména jako užitečný nástroj pro snadnější a rychlejší řešení problémů. Výhodou je, že ji můžete používat také offline. A může být užitečná také při vývoji metod.

• Aplikace Agilent InfinityLab HPLC Advisor

• Snadnější a rychlejší řešení problémů s LC

• Stažení přímo do Vašich chytrých zařízení umožní pomoc kdykoli a kdekoliv (také offline)

• Nezávisle na modelu LC

• Pomoc při vývoji metod

HPST: Agilent HPLC Advisor

V hlavní nabídce naleznete 3 položky

• troubleshooting
• kalkulátor
• knihovna dat

Po vstupu do sekce trobleshooting si zvolíme jaký problém se separací máme a poté vás aplikace provede jak postupovat a navrhne řešení.

V případě kalkulátoru mám vypočítá účinnost vaší kolony. V případě isokratické eluce vypočítá počet teoretických pater a při gradientové eluci píkovou kapacitu.

V knihovně dat naleznete dvě funkce a to konvertor, který vám provede přepočet mezi objemovými, tlakovými nebo hmotnostními jednotkami. A ve vzorcích můžete nalézt rovnici výpočtu Vam Deemterovi křivky nebo rovnici pro výpočet rozlišovací schopnosti.

Na poslední záložce naleznete další podpůrnou literaturu, nebo také Agilent LC produkty.

HPST: HPLC Advisor - Troubleshooting

Shrnutí

Při procesu řešení problémů v LC systému je základem prevence. Když už problém nastane je důležitá správná diagnostika a následné řešení. Představili jsme vám pár tipů od Agilent, které mohou předcházet vzniku problému.

Nicméně, pokud nastane jakýkoliv problém ve vašem LC systému a vy nevíte, co s tím můžete udělat, tak si s tím nemusíte dělat starosti. Můžete navštívit naše stránky a zadat servisní požadavek nebo se obrátit na náš servisní tým, kteří vám mohou pomoci.

Řešení problémů v HPLC – Troubleshooting:

1. PREVENCE
2. DIAGNOSTIKA
3. ŘEŠENÍ

HPST: Řešení problémů v HPLC – Troubleshooting

Nabídka řešení od Agilent

• InfinityLab Stay Safe promývací láhev

• InfinityLab Stay Safe bezpečnostní víčka

• Captiva EMR-Lipid filtry

• Agilent InfinityLab Quick Change inline filtr

• Aplikace Agilent InfinityLab HPLC Advisor