Doporučené postupy pro používání HPLC systému Agilent - autosamplery a inline filtry

V prvním díle série o postupech a doporučeních k práci s HPLC systémy Agilent Technologies jsme se blíže podívali na základní pravidla, práci s rozpouštědly, přípravou a úpravou vzorků před analýzou nebo jak HPLC systém propláchnout. Zdůraznili jsme pak denní a týdenní úkoly a co provést při zapnutí a vypnutí Vašeho kapalinového chromatografu.

Druhý díl byl tématicky zaměřen na odplyňovače a čerpadla, kde jsme věnovali prostor používaným rozpouštědlům a zaměřili se pak především na oplach těsnění HPLC čerpadel.

Doporučení pro autosamplery

• Před vypnutím nebo dlouhým pohotovostním režimem vždy:
  • Odstraňte pufr pomocí vody se stupněm HPLC (viz. „Postup propláchnutí“ v dalších dílech).
  • Proveďte alespoň 15 minut proplachování sampleru vodou (vnější oplachování jehel i zpětné proplachování sedla pro volbu vícenásobného oplachování).
  • Proveďte vizuální kontrolu, v případě potřeby ručně odstraňte zbytky soli.
  • Odstraňte znečišťující látky pomocí silného rozpouštědla, například pomocí čistého ACN.
  • Funkce automatického čištění slouží k propláchnutí sampleru a současně k přepínání nástřikového ventilu tam a zpět.

HPST: Nastavení funkce automatického čištění HPLC autosampleru Agilent

• Pro funkci oplachu jehly nebo zpětného proplachu sedýlka vždy používejte čisté oplachovací rozpouštědlo.
• Umístěte lahev s rozpouštědlem pro oplach jehly a zpětný proplach sedýlka k ostatním HPLC rozpouštědlům.
  • Používejte správné rozpouštědlo, podle vlastností vzorku a mobilní fáze.

POZNÁMKA: Složení rozpouštědla pro oplach jehly musí odpovídat co rozpouštědlu s největší silou (rozpouštělo s maximální rozpustností). Volba těchto promývacích rozpouštědel je součástí procesu vývoje metody. Směs 50 – 100 % organického rozpouštědla v destilované vodě je pro mnohé aplikace ideálním řešením.

• Zkontrolujte odpadní hadičku výstupu z oplachového portu do odpadní nádoby.
• Každou vialku naplňte dostatečným množstvím vzorku pro všechny nástřiky.
  • Používejte pouze vialky doporučené společností Agilent.
  • Vialky nepřeplňujte; doplňujte je pouze po hladinu 90 %.
  • V případě dávkování velkých objemů nebo opakovaných nástřiků ze stejné vialky použijte septa se štěrbinou.
• Proveďte filtraci, usazení nebo odstředění vzorku pro jeho oddělení od nerozpustných pevných částic.

POZNÁMKA: V rozpouštědle nesmějí být žádné cizí částice, musí být primárně vždy filtrované.

• Zajistěte, aby rozpouštědlo pro vzorky co možná nejvíce odpovídalo složení reálné mobilní fáze.

Vícenásobný oplach

Modul pro vícenásobný oplach je určen pro minimalizaci přenosu vzorků a lze ho nainstalovat do libovolného multisampleru Agilent.

Tato funkce minimalizuje přenos a kontaminaci u důležitých vzorků tím, že umožňuje:

• Vnější oplach jehly až třemi různými rozpouštědly
• Zpětné propláchnutí sedýlka až se třemi různými rozpouštědly

Použití funkce Vícenásobné oplachování se nedoporučuje u mobilních fází obsahujících soli, protože sůl krystalizuje na jehle a sedýlku jehly. Vzhledem k drahám průtoku modulu pro vícenásobný oplach platí, že když se dávkovací zařízení před násřikem přesune do výchozí polohy, mobilní fáze bude vytékat z hrotu jehly a může kápnout do sedýlka. Jedná se o očekávané chování, nezávislé na nastavení dráhy čištění násřiku a neznamená to žádnou netěsnost.

Je-li modul pro vícenásobný oplach instalován v systému s mobilními fázemi obsahujícími sůli, doporučuje se pro zabránění hromadění soli na jehle a sedle denně proplachovat multisampler vodou po dobu 15 minut a vizuálně zkontrolovat jehlu a sedýlko. V případě potřeby použijte k manuálnímu čištění jehly, sedýlka a dalších součástí, které stále obsahují zbytky soli, látku nepouštějící vlákna, namočenou v destilované vodě.

Kdy je vhodné používat modul pro vícenásobný oplach?

• Je-li systém určen pouze pro aplikace s reverzními fázemi a v mobilní fázi nejsou přítomny žádné látky náchylné na vysrážení.

• Je-li systém určen pro aplikace s mobilními fázemi obsahujícími soli, použití varianty vícenásobného oplachu se nedoporučuje. Pokud je však tento volitelný modul nainstalován, může dojít ke krystalizaci v oblasti jehly a sedýlka. Je proto vhodnédodržovat následující postupy:

  • Denně provádějte proplachování vodou po dobu 15 minut, aby se odstranily zbytky soli.
  • Proveďte vnější oplach jehly a zpětné propláchnutí sedýlka.
  • Vizuálně zkontrolujte jehlu / sedýko / proplachovací port, zda neobsahují zbytky soli.
  • V případě potřeby ručně vyčistěte jehlu / sedýlko / proplachovací port.

POZNÁMKA: Pokud tyto postupy nejsou dodržovány, dojde k ucpání jehly a sedýlka.

• Je-li systém určen pro střídavé aplikace s mobilními fázemi obsahujícími sůl a aplikacemi s reverzními fázemi, není možnost vícenásobné oplachu podporována. Existuje vysoké riziko, že budou nepřetržitě uvolňovány zbytky solí a buď naruší chromatografii reverzní fáze, nebo dokonce způsobí ucpání systému.

V průtokových cestách modulu pro vícenásobný oplach také postupně stárne značné množství rozpouštědla, což by mohlo vést ke zvýšenému pozadí u vysoce citlivých UV a MS měření. Aby se tento efekt minimalizoval, doporučuje se proplachovat rozpouštědlem každý používaný kanál Multiwash do promývacího portu a kanál S1 (počáteční chromatografické podmínky) do sedýlka po dobu alespoň 5 minut před zahájením Vaší HPLC analýzy.

Doporučení pro čerpadla a samplery s volitelným vřazeným (inline) filtrem

Limitujícím faktorem pro životnost UHPLC kolon je obvykle vysoký zpětný tlak. Částice ve vzorku se anhromadí na vstupní frite kolony, což způsobuje zvyšování zpětného tlaku až do okamžiku dosažení mezní hodnoty tlaku v systému. Pro zabránění ucpání kolony se doporučuje používání vřazeného filtru (inline). K ucpání kolon také často dochází, když příprava vzorku neumožňuje filtrování nebo když se ve vzorku vytváří sraženina.

Následující moduly mohou být vybaveny etra (vřazeným) inline filtrem:

• Kvartérní čerpadla (G7104A, G7104C, G4204A):
  • Sestava filtru zabudovaného do kapilár (5067-5407)
• Autosamplery 1290 Infinity a 1290 Infinity II Agilent (kromě G5668A, G7137A):
  • Sada filtrů 1290 Infinity II Inline (5067-6189)

Tyto vřazené (inline) filtry s nominální velikostí filtru 0,3 μm chrání UHPLC kolonu před zanesením částicemi ze vzorků nebo ze systému UHPLC.

Výhody filtrů inline:

• Velmi malý vnitřní objem
  • Delay volume s pevnou kapilárou 1,3 μL
  • Delay volume s flexibilní kapilárou 1,6 μL
• Určeno pro práci s vysokými tlaky (max. provozní tlak 1300 bar)

Instalace inline filtru do G4204A nebo G7104A se doporučuje jako ochrana systému před zablokováním v těchto případech:

• Jsou použity kombinace rozpouštědel, které mohou po smíchání způsobit srážení;
• Při provádění aplikací s pufrem nebo přídavnými látkami, pokud se používají kolony s malou velikostí částic

Obecné rady pro efektivní využití inline filtru:

• Před použitím proveďte filtraci rozpouštědel.
• Dodržujte osvědčené postupy.
• U čerpadel G4204A, G7104A/C jednou týdně provádějte zpětný proplach filtru v čerpadle (spusťte oplach filtru pomocí kontextového menu)

VAROVÁNÍ Poškození ventilu

• Režim proplachování filtru používejte pouze v případě, že je nainstalován inline filtr, jinak tlakový impulz může poškodit víceúčelový ventil.

• V případě inline filtrů nainstalovaných na autosampleru vyměnte vložku filtru (Vložka 0,3 μm pro inline filtr, 5/pk (5023-0271)) po každých 1000 násřících nebo v případě, kdy zpětný tlak stoupne o 15 %

POZNÁMKA Další reference naleznete v Technickém článku G7167-90130.

Výběr literatury na téma řešení problémů a údržba HPLC systému Agilent v knihovně LabRulezLCMS

• Preventive and Routine Maintenance for Your HPLC System (Prezentace | 2022)

• Get Your LC Back Up and Running After the Shut Down (Příručky | 2020)

• HPLC Troubleshooting Fundamentals (Prezentace | 2021)

• Top 10 HPLC Method Development Fails (Prezentace | 2022)

• Don’t Lose It: Troubleshooting Separation Changes (Prezentace | 2020)

• From HPLC Instrument to Column - Tracking Down the HPLC Problem (Prezentace | 2022)

• The Chromatography Checklist (Prezentace | 2018)

• Surviving Chromatography - Part 1: Preventive Action (Prezentace | 2019)

• Surviving Chromatography - Part 2: Corrective Action (Prezentace | 2018)

• LC Troubleshooting Guide - Your guide to solving common problems and staying productive (Postery | 2019)

• HPLC Column Troubleshooting: Is It Really The Column? (Prezentace | 2010)

• The Chromatography Detective: Troubleshooting Tips & Tools for LC & LCMS (Prezentace | 2018)

• All About LC Connections –What to Do to Make A Great One - HPLC educational webinar: Becoming a better chromatographer (Prezentace | 2021)

• It’s Not All About the Column: The Role of the Mobile Phase and Your Instrument (Prezentace | 2021)

• Tips and Tricks of HPLC System Troubleshooting (Prezentace | 2005)

• Maximize Performance and Minimize Maintenance with Genuine Agilent LC Spares (Technické články | 2015)

• Hydrophilic Interaction Chromatography Method Development and Troubleshooting (Technické články | 2018)

• Why Did That Happen? (Prezentace | 2021)

• Around the LC System in 45 Slides (Prezentace | 2016)

• Taking the Trouble Out of TroubleshootingIs It the Column, Method, or Instrument (Prezentace | 2016)