Všechny <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=48&amp;distributorItems=51">HPLC kolony Phenomenex</a> jsou před odesláním testovány v rámci kontroly kvality a uchovány v rozpouštědle, které je obecně stejné jako testovací rozpouštědlo, pokud není uvedeno jiné v CQA dokumentu dodávaném s kolonou.„Kondicionování kolony“ nebo „aktivace“ jsou termíny, které se často používají zaměnitelně. Jednoduše řečeno se tak označují kroky, podniknuté ke změně rozpouštědla ve kterém je kolona uchována, na rozpouštědla specifická pro danou analytickou metodu.<div><div>Při zvažování, jaké kondicionování je nutné, je třeba věnovat pozornost následujícímu:<ul><li>Přepravní rozpouštědlo</li><li>Požadovaná mobilní fáze pro analýzu</li></ul>Je třeba zvážit následující otázky:<ul><li>Jsou tyto dva systémy rozpouštědel mísitelné?</li><li>Obsahuje konečný systém rozpouštědel pufry, které se mohou vysrážet?</li></ul><figure class="image"><img style="aspect-ratio:400/247;" src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Kinetex_Core_Shell_HPLC_Columns_a720e2efe5.webp" alt="Phenomenex: Kinetex Core-Shell HPLC Columns" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Kinetex_Core_Shell_HPLC_Columns_a720e2efe5.webp 245w," sizes="100vw" width="400" height="247"></figure></div></div><div><div>Při práci s kolonami s reverzní fází, které se obvykle dodávají ve směsi acetonitril:voda v poměru 65:35 a obecně se používají se směsmi buď methanolu nebo acetonitrilu s vodou nebo pufrem, je často možné přejít přímo do plánované mobilní fáze. Pokud jsou koncentrace pufru vyšší než 20 mM, může být nutné nejprve přejít na nový poměr organiky a vody před přídavkem pufru, aby se snížilo jakékoli riziko vysrážení solí.Malý počet stacionárních fází (kyano, amino, diol) může být použit v normální fázi nebo v reverzní fázi. Obvykle se dodávají ve směsích s normální fází, a pokud mají být použity za podmínek reverzní fáze, je vyžadována výměna přes univerzálně mísitelné rozpouštědlo, pro které lze použít následující protokol:<ul><li>Přepravní rozpouštědlo hexan:ACN v poměru 99:1</li><li>Požadovaná mobilní fáze methanol:voda v poměru 50:50</li><li>Propláchněte kolonu THF nebo IPA v množství 30 objemů kolony</li><li>Propláchněte methanolem v množství 10 objemů kolony</li><li>Propláchněte směsí methanol:voda v poměru 50:50, dokud nedosáhnete stabilní základní linie (baseline)</li></ul>V tomto procesu se nejprve použije THF nebo IPA k odstranění hexanu z kolony. To je důležité, protože hexan se nemísí s methanolem ani vodou. Methanol pak nahradí THF nebo IPA v koloně před vlastní mobilní fázi. Při výběru mezi THF a IPA je třeba vzít v úvahu jaký HPLC systém používáte. Pokud jsou hadičky systému nebo armatury vyrobeny z PEEKu, nelze použít THF, a proto je preferována IPA. Pokud je systém z nerezové oceli, lze použít THF nebo IPA. THF má výhodu nižší viskozity.Při kondicionování kolony pro použití v gradientovém systému je dobrou praxí propláchnout kolonu silným rozpouštědlem (obecně rozpouštědlem B) před ekvilibrací kolony v počátečním bodě gradientu. Pomůže to zajistit, aby kolona poskytovala dobrou základní linii při spuštění gradientu. Před nástřikem testovacího standardu je rovněž dobré udělat dva nebo tři slepé gradienty.Často vyvstává otázka: „Jak poznám, že je kolona plně kondicionována?“ Existují dva užitečné způsoby, jak to určit.<ul><li>Při použití UV detektoru by měla být základní linie (baseline) plochá. Obecně při změně složení rozpouštědla se základní linie bude svažovat. Její vyrovnání je dobrá známka toho, že kolona dosáhla rovnováhy s mobilní fází a je připravena k použití.</li><li>Zpětný tlak: Při výměně rozpouštědel, buď během kondicionování nové kolony, nebo na konci gradientu, se zpětný tlak měřený systémem změní. Postupem času se tlak stabilizuje, což ukazuje, že kolona je ekvilibrována. To může být užitečné při práci se systémy MS, kde obecně není sledována základní linie (baseline).</li></ul></div></div>

Kondicionování/aktivace HPLC kolon

Jednou z nejčastějších příčin krátké životnosti kolony je kontaminace kolony, která často vede k vysokému zpětnému tlaku a takzvané „ucpané“ vstupní fritě.Tento technický tip si klade za cíl vysvětlit, co se děje, a také jak se lze vyhnout kontaminaci kolony.Při výrobě kolon pro HPLC a UHPLC na bázi částic se frity používají k zabránění vstupu cizího materiálu do kolony a k zabránění tomu, aby náplň z HPLC kolon neunikala. Tyto frity jsou kotouče z porézního kovu, obecně o porozitě 0,5, 1,0 nebo 2,0 µm. Pokud vzorky obsahují nerozpuštěný materiál, bude odfiltrován z proudu rozpouštědla mobilní fáze, který se nachází na vnější straně vstupní frity. Jak tento proces pokračuje, dostupný povrch frity pro průchod mobilní fáze se zmenšuje, což omezuje tok mobilní faze a zvyšuje protitlak. Nakonec je téměř nemožné protlačit rozpouštědlo přes fritu a čerpadlo HPLC se vypne.Tomuto procesu lze zabránit filtrací vzorků před nástřikem do HPLC systému. Obecně se doporučuje používat 0,45 µm porézní <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/products/phenex-syringe-filters?_gl=1*befa9s*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*MTc0MjI4MDQ5NC4yLjAuMTc0MjI4MDQ5NC4wLjAuMA..">stříkačkové filtry </a>pro vzorky, které budou měřeny na 5 µm kolonách, 0,2 µm filtry pro 3 µm kolony a menší. Je třeba dbát na to, aby v ideálním případě rozpouštědlo přidávané ke vzorku odpovídalo mobilní fázi. Pokud tomu tak není, můžete se stát, že některé složky vzorku jsou rozpustné v rozpouštědle přidávaného ke vzorku, což jim umožňuje projít filtrem injekční stříkačky.Když jsou vstřikovány do mobilní fáze, mohou se vysrážet a způsobit ucpání frity. Tomu lze předejít buď rozpuštěním vzorku v mobilní fázi, nebo alternativně instalací vstupní frity nebo<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/products/securityguard-lc-guard-cartridge-system?_gl=1*1bfvfj1*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*MTc0MjI4MDQ5NC4yLjAuMTc0MjI4MDQ5NC4wLjAuMA.."> guard cartridge</a> jako spotřebního vyvení, aby se zabránilo znečištění vstupu kolony. &nbsp;<blockquote>Případně máme tento <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://app.explore.phenomenex.com/e/er?s=822460770&amp;lid=8337&amp;elqTrackId=7D1B2E6743B19B5717AFAEFF00F8A51C&amp;elq=00000000000000000000000000000000&amp;elqaid=4836&amp;elqat=2&amp;elqak=8AF5E09C05D0B7BFE5B44C560E3733C27992CF7C906A90E1BF5C55FDC1EA7D8B80B0&amp;_gl=1*1uyr77*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*MTc0MjI4MDQ5NC4yLjAuMTc0MjI4MDQ5NC4wLjAuMA..">webový nástroj</a>, který vás provede výběrem ochranné kazety.</blockquote>

Kontaminace kolon – jak k ní dochází a jak se jí lze vyhnout

<h4>HPLC metoda - Proč je to důležité</h4>Následující technika související s metodou navrhuje vylepšení zvyšující výkon při všech separacích. Při použití kolon s core-shell částicemi mohou tyto techniky výrazně zlepšit výkon vaší metody.Metody HPLC by se měly nejprve zaměřit na zaostření vzorku na vstupu kolony a poté minimalizovat disperzi vzorku kolonou. Když minimalizujete rozšíření pásma snížením rozptylu vzorku, zlepšíte citlivost a rozlišení svého píku.&nbsp;Začlenění jednoduchého programování injektoru do metody může minimalizovat extra-column volume, aby se zlepšil tvar píku a účinnost, zejména pro rychlé LC separace.<h4>Problém: Všechny píky jsou široké</h4>1. Zkontrolujte objem nástřiku: Chyby v nasávání vzorků mohou negovat zvýšení výkonu, kterého můžete dosáhnout použitím core-shell částic. Pokud nastřikujete vzorek ve stejném organickém složení jako mobilní fáze za izokratických podmínek, bude počáteční šířka pásma na koloně přímo úměrná objemu nástřiku. Jako takový je do kolony vstřikován velkoobjemový vzorek jako široký pás a poskytuje nízkou účinnost.Řešení: Aby se snížila ztráta účinnosti u velkoobjemových nástřiků, je možné předem koncentrovat vzorek na začátku kolony pomocí slabšího ředícího roztoku než mobilní fáze. Můžete také snížit objem nástřiku. Pokud se používají kolony s vysokou účinností, je pro získání dobré odezvy signálu často zapotřebí menší množství vzorku.&nbsp;2. Zkontrolujte roztok k ředění vzorku: Pokud je organická síla roztoku větší než síla HPLC mobilní fáze, pak se vzorek nanese jako difúzní pás v čele HPLC kolony. K tomu může dojít v izokratických nebo gradientových metodách a může to negovat většinu výkonnostních výhod, které tyto kolony přináší.<ul><li>Gradientní metody, při kterých je vzorek vstřikován v silnějším rozpouštědle než mobilní fáze, vykazuje sloučenina tzv. surfovací účinky, což způsobí, že se píky rozšíří a rozdělí.</li><li>Izokratické metody, kde je rozpouštědlo silnější než mobilní fáze, povedou k nadměrné disperzi vzorku.</li></ul>Řešení: Nastříkněte slabé rozpouštědlo. Nejlepší je použít ředící roztok, který je slabší nebo roven organické síle mobilní fáze, aby se vzorek soustředil na začátku kolony, což by mělo za následek ostřejší píky (tj. vyšší účinnost).<h4>Cíl: Zkrátit čas metody (runtime) a kapacitu píků v gradientových metodách</h4>Zkontrolujte vstřikovací program: Extra-column volume předtím než způsobí disperzi vzorku na cestě do kolony; nástřiková smyčka je hlavním zdrojem extra-column volume.<figure class="image"><img style="aspect-ratio:464/251;" src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Optimalizace_LC_systemu_na_UHPLC_vykon_na_jakemkoliv_HPLC_2_71c1c46674.jpg" alt="Phenomenex: Obrázek 1" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Optimalizace_LC_systemu_na_UHPLC_vykon_na_jakemkoliv_HPLC_2_71c1c46674.jpg 245w," sizes="100vw" width="464" height="251"></figure>Řešení: Během analytické metody (poté, co vzorek opustil injektorovou smyčku) je možné smyčku obejít injektorovým programem. Tabulka 1 a obrázek 1 ukazují příklad, kdy je vstřikovací smyčka po injekci obcházena, aby se snížil objem prodlevy systému.<figure class="image"><img style="aspect-ratio:915/458;" src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Optimalizace_LC_systemu_na_UHPLC_vykon_na_jakemkoliv_HPLC_b5445a0d4c.jpg" alt="Phenomenex: Tabulka 1" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Optimalizace_LC_systemu_na_UHPLC_vykon_na_jakemkoliv_HPLC_b5445a0d4c.jpg 245w," sizes="100vw" width="915" height="458"></figure>

Optimalizace LC systému na UHPLC výkon na jakémkoliv HPLC

<h4>Shrnutí</h4>Současná nová léčiva se z pohledu chromatografie vyznačují řadou výzev, ať už je to detekce nebo rozlišení od koelujících nečistot, nicméně největší překážkou bývá retence a rozlišení polárních sloučenin, které nejsou vhodné pro typické podmínky reverzní fáze C18.Mnoho tradičních stacionárních fází HPLC s reverzní fází neposkytuje dostatečnou retenci pro mnohé ze stále se zvyšujícího počtu polárních sloučenin analyzovaných pomocí HPLC. Tyto sloučeniny jsou často buď nezachyceny nebo je jejich retence nedostačující a tudíž je narušen tvar píku či koelují s jinými analyty se slabou retencí. Slabě zadržované analyty eluují v oblasti iontové suprese, což způsobuje problémy v rámci LC-MS analýzy.Tento technický tip představuje <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=347&amp;manufacturerItems=50">HILIC HPLC kolony</a> jako alternativní možnost, která je účinná zejména pro LC-MS. HILIC používá k eluci polárních sloučenin vysoké hladiny organického rozpouštědla, což pomáhá zlepšit jejich ionizační účinnost během LC-MS.<h5>Tip:&nbsp;</h5>HILIC funguje tak, že zadržuje polární sloučeniny ve vodní vrstvě, která se tvoří na povrchu silika částic (obr.1).<figure class="image"><img style="aspect-ratio:800/425;" src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Uspesne_technicke_reseni_analytickych_metod_pomoci_HILIC_jako_alternativniho_retencniho_mechanismu_bb362df4ea.jpg" alt="Phenomenex: Úspěšné technické řešení analytických metod pomocí HILIC jako alternativního retenčního mechanismu: Obr. 1" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Uspesne_technicke_reseni_analytickych_metod_pomoci_HILIC_jako_alternativniho_retencniho_mechanismu_bb362df4ea.jpg 245w," sizes="100vw" width="800" height="425"></figure><div>Acetonitril (MeCN) je slabé rozpouštědlo používané v HILIC a amonný pufr je rozpouštědlo silné. Amonné soli jsou zásadní jako protiionty usnadňující tvorbu dvojvrstvy důležitou pro separaci, která je znázorněna na obr. 1.</div>Polární stacionární fáze přitahuje vodní vrstvu čímž podporuje retenci polárních sloučenin. Polární sloučeniny se eluují se zvyšujícím se množstvím vody, což narušuje retenci polárních analytů k polární stacionární fázi, nezbytné k vyvolání eluce.Je důležité před použitím HILIC kolonu prvně ekvilibrovat, abychom zajistili dostačný čas k vytovření vodní vrstvy. Pokud nedojde k její tvorbě, tak retence bude nekonzistentí a metoda nebude dostatečně robustní.Zmínili jsme použití amonných pufrů, ale v rámci metody HILIC však existuje několik dalších faktorů, které jsou stejně zásadní pro její úspěch.První je selektivita, pro kterou je klíčová spravná volba kolony. Stejně jako u kolon s reverzní fází existuje pro HILIC mnoho různých stacionárních fází a každá z nich se vyznačuje různou selektivitou a dalšími benefity. Doporučujeme Vám vždy prověřit 3 různé fáze, abyste se ujistili, která nabízí nejlepší selektivitu pro Vaši aplikaci.<h5>Mezi HILIC stacionární fáze, které byste mohli zvážit, patří:</h5><ul><li>nemodifikovaná silika jako <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=347&amp;manufacturerItems=50&amp;search=Kinetex">Kinetex HILIC</a></li><li>diolové fáze jako <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=347&amp;manufacturerItems=50&amp;search=Luna">Luna HILIC</a></li><li>NH2 fáze</li><li>iontové / zwitteriontové</li></ul>Pokud jde o mobilní fázi, je důležité použít MeCN jako organickou složku - protická rozpouštědla, jako je methanol, mohou narušit dvouvrstvou formaci, o které jsme mluvili. Důležité je také množství organické složky, jejiž příliš vysoké procento v počátečním gradientovém bodě zkomplikuje a prodlouží ekvilibraci dvouvrstvy; 90% organické složky je pro začátek ideální.Pokud je to možné, tak gradientový profil by měl být 90% MeCN - 50%. Tímto způsobem lze zajistit plnou ekvilibraci na začátku gradientu. Pokud jsou k eluci sloučeniny vyžadovány podmínky větší než 50% pufru, bude lepší volbou polární typ C18 stacionární fáze, nikoliv HILIC. Po každém gradientu je nutná ekvilibrace dvouvrstvy. Čím vyšší je procento pufru na konci gradientu, tím delší bude proces ekvilibrace. Nedostatečná ekvilibrace bude mít za následek zhoršenou reprodukovatelnost a metoda nebude dostatečně robustní.Posledním parametrem, který je potřeba vzít v úvahu, je pH. Měly by být testovány nejméně 2 různé hodnoty pH. Obvykle se doporučuje pH 3.2 s použitím mravenčanu amonného a 5.8 s použitím acetátu amonného. Různé hodnoty pH mohou vést k výrazně odlišným selektivitám (obr. 2).<div><figure class="image"><img style="aspect-ratio:940/317;" src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Uspesne_technicke_reseni_analytickych_metod_pomoci_HILIC_jako_alternativniho_retencniho_mechanismu_2_cfa1c4dd2b.jpg" alt="Phenomenex: Úspěšné technické řešení analytických metod pomocí HILIC jako alternativního retenčního mechanismu: Obr. 2 Zásadní rozdíly v eluci v závislosti na typu mobilní a stacionární fázi." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Uspesne_technicke_reseni_analytickych_metod_pomoci_HILIC_jako_alternativniho_retencniho_mechanismu_2_cfa1c4dd2b.jpg 245w," sizes="100vw" width="940" height="317"></figure>HILIC je mimořádně užitečný nástroj pro zlepšení retence polárních sloučenin. Tato technika patří k náročnějším pokud jde o robustnost metody, nicméně pečlivá volba mobilní fáze a parametrů metody může vést k úspěšným separacím i náročnějších sloučenin.</div>

Úspěšné technické řešení analytických metod pomocí HILIC jako alternativního retenčního mechanismu

Gradientová eluce v HPLC je skvělým nástrojem pro analýzu vzorků, jejichž analyty vykazují široké rozpětí retenčních sil na stacionární fázi zvolené chromatografické kolony. Gradienty však nemusí být vždy ideální z hlediska použití pufrů, zejména pokud se snažíme udržet specifickou hodnotu pH. Pokud je pufr omezen pouze na vodnou mobilní fázi a organická mobilní fáze zůstává čistým organickým rozpouštědlem, může gradient narážet na omezení v rozpustnosti a kolísání pufrační kapacity s rostoucím podílem organické fáze během průběhu gradientu. Tuto nevýhodu lze překonat rovnoměrným rozdělením pufru do obou mobilních fází („slabé“ i „silné“), jak si dále ukážeme na přístupech a příkladech.&nbsp;Co třeba přidat do obou mobilních fází kyselé nebo zásadité aditivum, například 0,1 % (v/v) kyseliny mravenčí (HCO₂H)?&nbsp;Takový přídavek do obou fází může pomoci udržet konzistentní koncentraci aditiva v celkové mobilní fázi během změny poměru mezi „slabou“ a „silnou“ mobilní fází. Nevýhodou tohoto přístupu je však volatilita aditiva, která může způsobit nestabilní protonaci či deprotonaci analytů. A někteří z nás si jistě přiznají, že ne vždy připravujeme (v/v) přídavky zcela přesně. Alternativně lze použít vhodný pufr s odpovídající solí pro konkrétní aditivum, který udrží stálé pH, při kterém je připraven, bez rizika odpařování aditiva.Pufry na bázi mravenčanu amonného (NH₄HCO₂) nebo acetátu amonného (NH₄CH₃CO₂) jsou pro gradientovou eluci nejvhodnější, protože jsou dobře rozpustné v methanolu, zatímco jejich vodné pufry lze mísit i s vysokými poměry acetonitrilu. Potřebná pufrační kapacita bývá zpravidla 5–10 mM v každé fázi. Pro srovnání: při izokratické eluci s mobilní fází 60:40 (20 mM pufr:acetonitril) je výsledná koncentrace pufru pouze 12 mM. Obr. 1 znázorňuje analýzu mykotoxinů na koloně <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/1514">Kinetex™ Bifenyl</a> s 5 mM pufrem acetátu amonného obsaženým ve vodné i methanolové fázi – acetát amonný byl přímo rozpuštěn v methanolu.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_3_788ba526cf.jpg" alt="Phenomenex: Vliv gradientu na pufrační kapacitu: Obrázek 1 – Analýza mykotoxinů na Kinetex Biphenyl (ID aplikace 21951)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_3_788ba526cf.jpg 245w," sizes="100vw" width="904" height="475">Při použití acetonitrilu je třeba jej míchat s vodným pufrem, aby byla zachována rozpustnost pufrovací soli. &nbsp;Obr. 2 znázorňuje HILIC analýzu nederivatizovaných aminokyselin na koloně <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/1542">Biozen™ Glycan</a>, kde byl zásobní pufr (100 mM mravenčan amonný, pH 3,1) přidán do vody i do acetonitrilu v poměru 9:1 (rozpouštědlo:pufr). Výsledná koncentrace pufru v obou fázích byla 10 mM, což udrželo konzistentní pufrační sílu v průběhu gradientu.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_2_bb25c9ae6a.jpg" alt="Phenomenex: Vliv gradientu na pufrační kapacitu: Obrázek 2 – Nederivatizované aminokyseliny na bioZen Glycan (technická poznámka 1264)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_2_bb25c9ae6a.jpg 245w," sizes="100vw" width="987" height="486">Fluorid amonný (NH₄F) se často přidává v malém množství (0,1–0,2 mM) do mobilní fáze pro dosažení vysoce citlivých fluoridových aduktů [M+F]⁻ v režimu ESI⁻ nebo pro podporu tvorby iontů [M+H]⁺ nebo [M+NH₄]⁺ v ESI⁺ režimu. Obr. 3 znázorňuje použití třetího rozpouštědlového kanálu, kterým je 1 mM NH₄F dodáván v konstantním poměru 10 % do celkové mobilní fáze, čímž je zajištěna stálá koncentrace 0,1 mM v celém gradientu. Tato metoda je umožněna ternárními nebo kvarterními pumpami, přičemž se doporučuje izokratické zdržení na začátku metody kvůli lepší přenositelnosti metody mezi různými přístroji. Takové gradienty jsou totiž ovlivněny tzv. „dwell volume“, specifickým pro každý HPLC systém, a to i tehdy, pokud je jedno z rozpouštědel dávkováno konstantně.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_dd2c7475e7.jpg" alt="Phenomenex: Vliv gradientu na pufrační kapacitu: Obrázek 3 – Mikrocystiny na Luna Omega Polar C18 (ID aplikace 23568)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_dd2c7475e7.jpg 245w," sizes="100vw" width="1071" height="550">Dejte si pozor na rozpustnost pufrů, pokud chcete do gradientu zařadit pufry jako hydrogenuhličitan amonný nebo fosfátové pufry, zejména právě fosfátové. Při vyšším obsahu organického rozpouštědla může dojít k precipitaci a doporučuje se nejprve provést studii rozpustnosti. A nakonec – nezapomeňte zahrnout použitý pufr také do ředicího roztoku vzorku, aby bylo pH sladěno s mobilní fází. To zlepší tvar píků i reprodukovatelnost. Gradientová eluce, u níž je udržována konstantní pufrační síla a hodnota pH, významně zvyšuje spolehlivost HPLC metody.

Vliv gradientu na pufrační kapacitu

Při hodnocení dat z HPLC analýzy se pozornost obvykle soustředí na retenční čas, asymetrii píku a účinnost. Tyto parametry umožňují identifikaci a kvantifikaci analytů – čím přesnější jsou tyto informace, tím vyšší je spolehlivost identifikace píku a koncentrace analytu.Kapacitní faktor bývá často opomíjeným parametrem separací, avšak při správném využití může výrazně přispět k vývoji robustnější analytické metody. Kapacitní faktor normalizuje retenční čas analytu vzhledem k rozměrům chromatografické kolony a je definován vztahem:<h5 style="text-align:center;">K' = (tᵣ − t₀) / t₀</h5>kde tᵣ je retenční čas analytu a t₀ je retenční čas nezadržované sloučeniny.Význam kapacitního faktoru lze nejlépe demonstrovat na příkladu:<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_2_f6553ef593.jpg" alt="Phenomenex: Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody? 1. Kyselina šťavelová, 2. Kyselina vinná, 3. Kyselina glykolová, 4. Kyselina mravenčí, 5. Kyselina pyrohroznová, 6. Kyselina malonová, 7. Kyselina octová, 8. Kyselina maleinová, 9. Kyselina citronová." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_2_f6553ef593.jpg 245w," sizes="100vw" width="547" height="345">Zde máme separaci organických kyselin provedenou na koloně C18, která je stabilní až do 100% vodného prostředí. Mobilní fází je 20 mM fosfátový pufr o pH 2,9 s průtokem 0,7 ml/min. Na první pohled se zdá, že retence kyseliny šťavelové je téměř 4 minuty, ale při bližším pohledu je t₀ pro tuto kolonu přibližně 3,7 minuty. Pokud toto zohledníme, je zřejmé, že kyselina šťavelová – velmi polární dikyselina – nevykazuje prakticky žádnou retenci.<h5 style="text-align:center;">K' = (3,9 – 3,7) / 3,7 = 0,054</h5>To znamená, že kyselina šťavelová tráví během průchodu kolonou jen minimální čas ve stacionární fázi. V takových případech je retence analytu výrazně ovlivněna i drobnými, neúmyslnými změnami parametrů, jako jsou:<ul><li>složení mobilní fáze</li><li>pH mobilní fáze</li><li>síla rozpouštědla vzorku</li><li>teplota</li></ul>Taková metoda pravděpodobně nebude robustní, protože retence kyseliny šťavelové se bude lišit od jednoho běhu ke druhému, mezi různými kolonami nebo mezi šaržemi mobilní fáze.Z toho vyplývá doporučení, aby se při vývoji metod udržovaly kapacitní faktory v rozmezí 2–10. Viděli jsme potenciální problémy s kapacitními faktory menšími než 2, ale proč se zastavit právě na horní hranici 10?Při izokratické eluci se šířka píku zvyšuje s rostoucí retenční dobou vlivem difúze. Použití kolon s menšími částicemi a optimalizace průtoku může tento efekt částečně zmírnit, ale nelze jej zcela eliminovat. Navíc vysoké kapacitní faktory vedou k dlouhým retenčním časům, což je v rutinním laboratorním provozu obecně nežádoucí.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_22b7c55c44.jpg" alt="Phenomenex: Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody? 1. Hydrokortizon, 2. Kortikosteron, 3. 11-a-hydroxytestosteron, 4. Kortizon acetát, 5. 11-ketoprogesteron." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_22b7c55c44.jpg 245w," sizes="100vw" width="685" height="339">Zde máme příklad analýzy steroidů na koloně o rozměrech 150 × 4,6 mm při průtoku 1 ml/min. 11-etoprogesteron eluoval přibližně po 17,5 minutách s kapacitním faktorem přibližně 10,6. Za těchto podmínek izokratické eluce je patrné, že došlo k rozšíření píků, což naznačuje, že poslední eluující analyty jsou na koloně zadržovány příliš dlouho.Porozumění obecnému doporučení (kapacitní faktory mezi 2 a 10) je užitečné, ale zůstává otázkou, jak kapacitní faktor účinně upravit?Kapacitní faktor je nepřímo úměrný eluční síle mobilní fáze – vyšší eluční síla snižuje kapacitní faktor a naopak. Pokud nelze nízký kapacitní faktor zvýšit snížením eluční síly mobilní fáze, může být vhodné přejít na stacionární fázi, která nabízí vyšší retenci analytů, například zvolit polárnější stacionární fázi pro separaci polárních analytů.

Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody?

Jednou z nejčastějších příčin krátké životnosti kolony je její kontaminace, která často vede k vysokému protitlaku a takzvanému „ucpání“ vstupní frity.Tento technický tip má za cíl vysvětlit, co se při tom děje, a také jak lze kontaminaci kolony předcházet.Při výrobě HPLC a UHPLC kolon plněných částicemi se používají frity, které zabraňují vniknutí cizorodých látek do kolony a zároveň brání ztrátě stacionární fáze. Tyto frity jsou porézní kovové disky s velikostí pórů obvykle 0,5, 1,0 nebo 2,0 μm. Pokud vzorky obsahují nerozpuštěný materiál, zachytí se na vnější straně vstupní frity. Jak tento proces pokračuje, průtočná plocha frity se zmenšuje, což omezuje průtok mobilní fáze a tím dochází ke zvýšení protitlaku. Nakonec se stane nemožné protlačit rozpouštědlo fritou a HPLC čerpadlo se zastaví.Tomu lze předejít filtrací vzorků před vstřikováním do HPLC systému. Obecně se doporučuje používat stříkačkové filtry s porézností 0,45 μm pro vzorky analyzované na 5μm kolonách a 0,2 μm filtry pro 3μm kolony a menší. Je třeba dbát na to, aby rozpouštědlo vzorku ideálně odpovídalo mobilní fázi. Pokud tomu tak není, mohou být některé složky vzorku rozpustné v rozpouštědle a projdou tak filtrem. Při vstřiku do mobilní fáze se však mohou vysrážet a ucpat fritu. Tomu lze zabránit buď rozpuštěním vzorku přímo v mobilní fázi, nebo instalací vstupní frity či předkolony jako obětního prvku, který zabrání znečištění samotného vstupu kolony.Alternativně můžete využít i náš <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/tools/security-guard-selection#bybrand">webový nástroj</a>, který vás provede výběrem vhodné předkolony.

Kontaminace kolony – co se děje a jak tomu lze zabránit

<h3>Význam metody HPLC</h3>Zvýšení účinnosti chromatografických separací lze dosáhnout pomocí následujících tipů pro optimalizaci metod. Tyto postupy mohou výrazně zlepšit výkon, zejména při použití kolon s částicemi typu core-shell.Při optimalizaci metod HPLC je klíčové minimalizovat disperzi vzorku, aby se předešlo rozšiřování píků a zlepšila citlivost i rozlišení. To znamená zajistit, aby byl vzorek při nástřiku koncentrován jako úzké pásmo na začátku kolony, a následně omezit jeho disperzi při průchodu kolonou.Úprava objemu nástřiku a volba vhodného rozpouštědla vzorku mohou významně omezit disperzi spojenou s dávkováním vzorku. Stejně tak může pomoci jednoduché programování autosampleru, které snižuje disperzi způsobenou nežádoucím mimokolonovým objemem. Tato doporučení vedou k lepšímu tvaru píků a vyšší účinnosti, zejména u rychlých separací na kolonách typu core-shell.<h3>Problém: všechny píky jsou široké</h3><h4>Zkontrolujte objem nástřiku</h4>Chyby při dávkování vzorku mohou zcela eliminovat výhody kolon s částicemi typu core-shell. Pokud je vzorek nastříknut ve stejném obsahu organické složky jako má mobilní fáze za izokratických podmínek, počáteční šířka pásma na koloně je přímo úměrná nástřikovému objemu. Vysoký objem tedy vede k širokému pásmu a nižší účinnosti separace.Řešení: Pro omezení ztráty účinnosti při velkoobjemových nástřicích lze vzorek předkoncentrovat na začátku kolony použitím rozpouštědla s nižším obsahem organické složky než má mobilní fáze. Další možností je zmenšit objem nástřiku. Při použití vysoce účinných kolon obvykle stačí k dosažení dobré odezvy signálu menší množství vzorku.<h4>Zkontrolujte rozpouštědlo vzorku</h4>Pokud má rozpouštědlo vyšší organickou sílu než mobilní fáze, vzorek se na začátku kolony rozloží jako difuzní pásmo. To může nastat jak u izokratických, tak u gradientových metod a výrazně snížit přínos kolony.<ul><li>U gradientových metod, kdy je vzorek nanesen v silnějším rozpouštědle než mobilní fáze, dochází k tzv. surfing efektu (surfing effect), který způsobuje rozšiřování a štěpení píků.</li><li>U izokratických metod dochází vlivem silnějšího rozpouštědla než je mobilní fáze k nadměrné disperzi vzorku.</li></ul>Řešení: Používejte slabší rozpouštědlo. Nejvhodnější je použít rozpouštědlo stejné nebo slabší organické síly než má mobilní fáze. To soustředí vzorek na začátku kolony a vede k ostřejším píkům (vyšší účinnosti).<h3>Cíl: zkrácení doby analýzy a zvýšení účinnosti u gradientových metod</h3><h4>Zkontrolujte program autosampleru</h4>Mimokolonový objem před kolonou způsobuje disperzi vzorku. Hlavním zdrojem tohoto objemu je dávkovací smyčka.Řešení: Smyčku lze obejít pomocí programu autosampleru během metody (po opuštění smyčky vzorkem). Tabulka 1 a obrázek 1 ukazují příklad, kdy je dávkovací smyčka po nástřiku vyřazena z průtoku, čímž se snižuje mimokolonový objem systému.<h4>Kroky | Příkazy| Komentáře</h4>1 | DRAW | Odeberte objem vzorku (nástřikový objem) z vialky. 2 | INJECT | Nastříkněte vzorek do průtokové cesty. 3 | WAIT | Propláchněte dávkovací smyčku po nástřiku (čekací doba = 6× (nástřikový objem + 5 µL) / průtok). 4 | VALVE bypass | Nasměrujte tok z čerpadla přímo do kolony, obejděte nástřikový ventil a vylučte mrtvý objem ~200–500 µL z cesty autosampleru. 5 | WAIT 1.5 min | Doba trvání obtokového režimu (čekací doba = doba analýzy – 1 min). 6 | VALVE reinject | Přepněte ventil zpět do polohy nástřik.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_LC_System_Optimisation_for_UHPLC_Performance_on_any_HPLC_0bd7e07b05.jpg" alt="Phenomenex: Optimalizace LC systému pro dosažení UHPLC výkonnosti na jakémkoli HPLC" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_LC_System_Optimisation_for_UHPLC_Performance_on_any_HPLC_0bd7e07b05.jpg 245w," sizes="100vw" width="464" height="251">* Mainpass peak je falešný pík vznikající při přepnutí dávkovacího ventilu zpět do průtokové cesty, kdy je do toku znovu zařazena dávkovací smyčka (pro její proplach a přípravu na další nástřik).

Optimalizace LC systému pro dosažení UHPLC výkonnosti na jakémkoli HPLC

Klinický význam oligonukleotidů, které umožňují kontrolu genové exprese, činí z těchto molekul stále atraktivnější kandidáty pro terapeutické využití. Oligonukleotidy se však výrazně liší svými chemickými vlastnostmi od běžných léčiv na bázi malých molekul – jsou zajímavým, ale zároveň náročným analytickým cílem. Vzhledem ke své vysoké polaritě vyžadují specifické podmínky pro úplnou charakterizaci včetně stanovení nečistot.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/oligonucleotide_2_3d8377cbf6.jpg" alt="Phenomenex: Oligonukleotid" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_oligonucleotide_2_3d8377cbf6.jpg 125w," sizes="100vw" width="505" height="628">V <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/article/6261">části 1</a> jsme se nejprve zabývali některými strategiemi vývoje metod pro analýzu oligonukleotidů. V této druhé části se budeme zabývat vlivem hardwaru HPLC kolony na analýzu, konkrétně rozlišením, citlivostí a tvorbou aduktů.<h4>Zlepšení rozlišení</h4>Je dobře známo, že velké biomolekuly, jako například proteiny, mají tendenci adsorbovat na nerezovou ocel, což vyžaduje úpravu kolony při separaci těchto látek. Pro minimalizaci tohoto jevu lze využít neadsorpční, bioinertní kolony, jako je BioTi™ z řady <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?manufacturerItems=50&amp;search=biozen">Biozen™</a>. Při analýze oligonukleotidů lze pozorovat podobný efekt — jejich fosforylovaná páteř zvyšuje náchylnost k adsorpci na kovové povrchy. Použití BioTi hardwaru tento problém účinně eliminuje a přináší výrazné zlepšení chromatografického rozlišení.Na obr. 1 jsou srovnány výsledky analýzy dvouvláknové siRNA na dvou kolonách se stejným organokřemičitým plnivem (core-shell hybrid). Jedna kolona byla naplněna v nerezovém pouzdře, druhá v BioTi. U nerezové varianty byl patrný špatný tvar píku a ztráta rozlišení mezi "sense" a "antisense" řetězcem, zatímco BioTi vykazovala ostré a symetrické píky. To dále potvrzují spektra na obrázku 2, která ukazují bimodalitu antisense řetězce. Naopak s hardwarem BioTi jsme schopni dosáhnout dobrého rozlišení a ostrých píků. Spektra na obrázku 3 dále dokazují, že hardware BioTi poskytuje jasné rozdělení mezi sense a antisense řetězci.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Figure_1_3524e03533.jpg" alt="Phenomenex: Obrázek 1" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Figure_1_3524e03533.jpg 245w," sizes="100vw" width="1422" height="600"><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Figure_2_bd0aa7e66d.jpg" alt="Phenomenex: Obrázek 2" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Figure_2_bd0aa7e66d.jpg 245w," sizes="100vw" width="1424" height="450"><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Figure_3_bdc9ba4043.jpg" alt="Phenomenex: Obrázek 3" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Figure_3_bdc9ba4043.jpg 245w," sizes="100vw" width="1419" height="437"><h4>Zvýšení citlivosti</h4>Při použití nerezového hardwaru může docházet ke ztrátám analytu vlivem adsorpce, což snižuje citlivost analýzy – problém zejména při práci s velmi malým množstvím vzorku, například při biodistribučních studiích.Na obr. 4 je porovnána odezva (signál) u dvou oligonukleotidů, BNA a 5amC12, analyzovaných za totožných podmínek. Kolona s BioTi hardwarem poskytla silný a konzistentní signál, zatímco na nerezové koloně došlo k úplné adsorpci vzorku a ztrátě analytu.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Figure_4_9a31caf063.jpg" alt="Phenomenex: Obrázek 4" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Figure_4_9a31caf063.jpg 245w," sizes="100vw" width="1419" height="495"><h4>Snížení tvorby aduktů</h4>Jedním z častých problémů LC-MS analýzy oligonukleotidů je tvorba aduktů. Pro snížení jejich výskytu se doporučuje pasivace systému – proplach systému a kolony 0,1% roztokem kyseliny mravenčí. Důvodem je, že mobilní fáze používané v LC-MS analýzách oligonukleotidů často obsahují přísady vytvářející zásadité prostředí, což vede k hromadění kovových zbytků z mobilních fází, stacionární fáze a hardwaru. Tyto kovy mohou snižovat citlivost detekce a zhoršovat kvalitu spekter.Na obr. 5 jsou porovnána spektra oligonukleotidu nusinersen získaná na kolonách s nerezovým a BioTi hardwarem. V dekonvoluovaném spektru nerezové kolony se objevuje adukt o hmotnosti 62 Da, který u BioTi zcela chybí – důkaz lepší chemické inertnosti.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Figure_5_def677c204.jpg" alt="Phenomenex: Obrázek 5" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Figure_5_def677c204.jpg 245w," sizes="100vw" width="1424" height="726"><h4>Shrnutí</h4>Použití bioinertního hardwaru BioTi™ při analýze oligonukleotidů přináší jednoznačné výhody:<ul><li>zlepšení rozlišení mezi jednotlivými řetězci,</li><li>zvýšení citlivosti díky minimalizaci adsorpce,</li><li>snížení tvorby aduktů a zlepšení kvality hmotnostních spekter.</li></ul>BioTi představuje efektivní řešení pro přesnější, citlivější a spolehlivější LC-MS analýzu oligonukleotidů v moderních bioanalytických laboratořích.

Využití bioinertního hardwaru při analýze oligonukleotidů

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Video

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Společnost Phenomenex je celosvětovým technologickým lídrem, který se zabývá vývojem nových řešení v oblasti analytické chemie, jež řeší požadavky analytiků na separace a purifikace v průmyslových, vládních a akademických laboratořích.

Phenomenex

Moderní elektroanalytické metody (Cena Metrohm 2026)

ALS Kurz Analýzou HYDRAULICKÝCH a TURBÍNOVÝCH olejů k větší efektivitě výroby

Praktický kurz ŠKOLA HPLC

Big Scale, Big Wins: Prep Chromatography Explained

High-throughput stability screening strategies for antibody formulation

PFAS in Food & Food Contact Material