Optimalizace LC systému pro dosažení UHPLC výkonnosti na jakémkoli HPLC

Význam metody HPLC

Zvýšení účinnosti chromatografických separací lze dosáhnout pomocí následujících tipů pro optimalizaci metod. Tyto postupy mohou výrazně zlepšit výkon, zejména při použití kolon s částicemi typu core-shell.

Při optimalizaci metod HPLC je klíčové minimalizovat disperzi vzorku, aby se předešlo rozšiřování píků a zlepšila citlivost i rozlišení. To znamená zajistit, aby byl vzorek při nástřiku koncentrován jako úzké pásmo na začátku kolony, a následně omezit jeho disperzi při průchodu kolonou.

Úprava objemu nástřiku a volba vhodného rozpouštědla vzorku mohou významně omezit disperzi spojenou s dávkováním vzorku. Stejně tak může pomoci jednoduché programování autosampleru, které snižuje disperzi způsobenou nežádoucím mimokolonovým objemem. Tato doporučení vedou k lepšímu tvaru píků a vyšší účinnosti, zejména u rychlých separací na kolonách typu core-shell.

Problém: všechny píky jsou široké

Zkontrolujte objem nástřiku

Chyby při dávkování vzorku mohou zcela eliminovat výhody kolon s částicemi typu core-shell. Pokud je vzorek nastříknut ve stejném obsahu organické složky jako má mobilní fáze za izokratických podmínek, počáteční šířka pásma na koloně je přímo úměrná nástřikovému objemu. Vysoký objem tedy vede k širokému pásmu a nižší účinnosti separace.

Řešení:
Pro omezení ztráty účinnosti při velkoobjemových nástřicích lze vzorek předkoncentrovat na začátku kolony použitím rozpouštědla s nižším obsahem organické složky než má mobilní fáze. Další možností je zmenšit objem nástřiku. Při použití vysoce účinných kolon obvykle stačí k dosažení dobré odezvy signálu menší množství vzorku.

Zkontrolujte rozpouštědlo vzorku

Pokud má rozpouštědlo vyšší organickou sílu než mobilní fáze, vzorek se na začátku kolony rozloží jako difuzní pásmo. To může nastat jak u izokratických, tak u gradientových metod a výrazně snížit přínos kolony.

• U gradientových metod, kdy je vzorek nanesen v silnějším rozpouštědle než mobilní fáze, dochází k tzv. surfing efektu (surfing effect), který způsobuje rozšiřování a štěpení píků.
• U izokratických metod dochází vlivem silnějšího rozpouštědla než je mobilní fáze k nadměrné disperzi vzorku.

Řešení:
Používejte slabší rozpouštědlo. Nejvhodnější je použít rozpouštědlo stejné nebo slabší organické síly než má mobilní fáze. To soustředí vzorek na začátku kolony a vede k ostřejším píkům (vyšší účinnosti).

Cíl: zkrácení doby analýzy a zvýšení účinnosti u gradientových metod

Zkontrolujte program autosampleru

Mimokolonový objem před kolonou způsobuje disperzi vzorku. Hlavním zdrojem tohoto objemu je dávkovací smyčka.

Řešení:
Smyčku lze obejít pomocí programu autosampleru během metody (po opuštění smyčky vzorkem). Tabulka 1 a obrázek 1 ukazují příklad, kdy je dávkovací smyčka po nástřiku vyřazena z průtoku, čímž se snižuje mimokolonový objem systému.

Kroky | Příkazy| Komentáře

1 | DRAW | Odeberte objem vzorku (nástřikový objem) z vialky.
2 | INJECT | Nastříkněte vzorek do průtokové cesty.
3 | WAIT | Propláchněte dávkovací smyčku po nástřiku (čekací doba = 6× (nástřikový objem + 5 µL) / průtok).
4 | VALVE bypass | Nasměrujte tok z čerpadla přímo do kolony, obejděte nástřikový ventil a vylučte mrtvý objem ~200–500 µL z cesty autosampleru.
5 | WAIT 1.5 min | Doba trvání obtokového režimu (čekací doba = doba analýzy – 1 min).
6 | VALVE reinject | Přepněte ventil zpět do polohy nástřik.

Phenomenex: Optimalizace LC systému pro dosažení UHPLC výkonnosti na jakémkoli HPLC

* Mainpass peak je falešný pík vznikající při přepnutí dávkovacího ventilu zpět do průtokové cesty, kdy je do toku znovu zařazena dávkovací smyčka (pro její proplach a přípravu na další nástřik).