Využití bioinertního hardwaru při analýze oligonukleotidů

Klinický význam oligonukleotidů, které umožňují kontrolu genové exprese, činí z těchto molekul stále atraktivnější kandidáty pro terapeutické využití. Oligonukleotidy se však výrazně liší svými chemickými vlastnostmi od běžných léčiv na bázi malých molekul – jsou zajímavým, ale zároveň náročným analytickým cílem. Vzhledem ke své vysoké polaritě vyžadují specifické podmínky pro úplnou charakterizaci včetně stanovení nečistot.

Phenomenex: Oligonukleotid

V části 1 jsme se nejprve zabývali některými strategiemi vývoje metod pro analýzu oligonukleotidů. V této druhé části se budeme zabývat vlivem hardwaru HPLC kolony na analýzu, konkrétně rozlišením, citlivostí a tvorbou aduktů.

Zlepšení rozlišení

Je dobře známo, že velké biomolekuly, jako například proteiny, mají tendenci adsorbovat na nerezovou ocel, což vyžaduje úpravu kolony při separaci těchto látek. Pro minimalizaci tohoto jevu lze využít neadsorpční, bioinertní kolony, jako je BioTi™ z řady Biozen™.
Při analýze oligonukleotidů lze pozorovat podobný efekt — jejich fosforylovaná páteř zvyšuje náchylnost k adsorpci na kovové povrchy. Použití BioTi hardwaru tento problém účinně eliminuje a přináší výrazné zlepšení chromatografického rozlišení.

Na obr. 1 jsou srovnány výsledky analýzy dvouvláknové siRNA na dvou kolonách se stejným organokřemičitým plnivem (core-shell hybrid). Jedna kolona byla naplněna v nerezovém pouzdře, druhá v BioTi. U nerezové varianty byl patrný špatný tvar píku a ztráta rozlišení mezi "sense" a "antisense" řetězcem, zatímco BioTi vykazovala ostré a symetrické píky. To dále potvrzují spektra na obrázku 2, která ukazují bimodalitu antisense řetězce. Naopak s hardwarem BioTi jsme schopni dosáhnout dobrého rozlišení a ostrých píků. Spektra na obrázku 3 dále dokazují, že hardware BioTi poskytuje jasné rozdělení mezi sense a antisense řetězci.

Phenomenex: Obrázek 1

Phenomenex: Obrázek 2

Phenomenex: Obrázek 3

Zvýšení citlivosti

Při použití nerezového hardwaru může docházet ke ztrátám analytu vlivem adsorpce, což snižuje citlivost analýzy – problém zejména při práci s velmi malým množstvím vzorku, například při biodistribučních studiích.

Na obr. 4 je porovnána odezva (signál) u dvou oligonukleotidů, BNA a 5amC12, analyzovaných za totožných podmínek. Kolona s BioTi hardwarem poskytla silný a konzistentní signál, zatímco na nerezové koloně došlo k úplné adsorpci vzorku a ztrátě analytu.

Phenomenex: Obrázek 4

Snížení tvorby aduktů

Jedním z častých problémů LC-MS analýzy oligonukleotidů je tvorba aduktů. Pro snížení jejich výskytu se doporučuje pasivace systému – proplach systému a kolony 0,1% roztokem kyseliny mravenčí.
Důvodem je, že mobilní fáze používané v LC-MS analýzách oligonukleotidů často obsahují přísady vytvářející zásadité prostředí, což vede k hromadění kovových zbytků z mobilních fází, stacionární fáze a hardwaru. Tyto kovy mohou snižovat citlivost detekce a zhoršovat kvalitu spekter.

Na obr. 5 jsou porovnána spektra oligonukleotidu nusinersen získaná na kolonách s nerezovým a BioTi hardwarem. V dekonvoluovaném spektru nerezové kolony se objevuje adukt o hmotnosti 62 Da, který u BioTi zcela chybí – důkaz lepší chemické inertnosti.

Phenomenex: Obrázek 5

Shrnutí

Použití bioinertního hardwaru BioTi™ při analýze oligonukleotidů přináší jednoznačné výhody:

• zlepšení rozlišení mezi jednotlivými řetězci,
• zvýšení citlivosti díky minimalizaci adsorpce,
• snížení tvorby aduktů a zlepšení kvality hmotnostních spekter.

BioTi představuje efektivní řešení pro přesnější, citlivější a spolehlivější LC-MS analýzu oligonukleotidů v moderních bioanalytických laboratořích.