Všechny <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=48&amp;distributorItems=51">HPLC kolony Phenomenex</a> jsou před odesláním testovány v rámci kontroly kvality a uchovány v rozpouštědle, které je obecně stejné jako testovací rozpouštědlo, pokud není uvedeno jiné v CQA dokumentu dodávaném s kolonou.„Kondicionování kolony“ nebo „aktivace“ jsou termíny, které se často používají zaměnitelně. Jednoduše řečeno se tak označují kroky, podniknuté ke změně rozpouštědla ve kterém je kolona uchována, na rozpouštědla specifická pro danou analytickou metodu.<div><div>Při zvažování, jaké kondicionování je nutné, je třeba věnovat pozornost následujícímu:<ul><li>Přepravní rozpouštědlo</li><li>Požadovaná mobilní fáze pro analýzu</li></ul>Je třeba zvážit následující otázky:<ul><li>Jsou tyto dva systémy rozpouštědel mísitelné?</li><li>Obsahuje konečný systém rozpouštědel pufry, které se mohou vysrážet?</li></ul><figure class="image"><img style="aspect-ratio:400/247;" src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Kinetex_Core_Shell_HPLC_Columns_a720e2efe5.webp" alt="Phenomenex: Kinetex Core-Shell HPLC Columns" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Kinetex_Core_Shell_HPLC_Columns_a720e2efe5.webp 245w," sizes="100vw" width="400" height="247"></figure></div></div><div><div>Při práci s kolonami s reverzní fází, které se obvykle dodávají ve směsi acetonitril:voda v poměru 65:35 a obecně se používají se směsmi buď methanolu nebo acetonitrilu s vodou nebo pufrem, je často možné přejít přímo do plánované mobilní fáze. Pokud jsou koncentrace pufru vyšší než 20 mM, může být nutné nejprve přejít na nový poměr organiky a vody před přídavkem pufru, aby se snížilo jakékoli riziko vysrážení solí.Malý počet stacionárních fází (kyano, amino, diol) může být použit v normální fázi nebo v reverzní fázi. Obvykle se dodávají ve směsích s normální fází, a pokud mají být použity za podmínek reverzní fáze, je vyžadována výměna přes univerzálně mísitelné rozpouštědlo, pro které lze použít následující protokol:<ul><li>Přepravní rozpouštědlo hexan:ACN v poměru 99:1</li><li>Požadovaná mobilní fáze methanol:voda v poměru 50:50</li><li>Propláchněte kolonu THF nebo IPA v množství 30 objemů kolony</li><li>Propláchněte methanolem v množství 10 objemů kolony</li><li>Propláchněte směsí methanol:voda v poměru 50:50, dokud nedosáhnete stabilní základní linie (baseline)</li></ul>V tomto procesu se nejprve použije THF nebo IPA k odstranění hexanu z kolony. To je důležité, protože hexan se nemísí s methanolem ani vodou. Methanol pak nahradí THF nebo IPA v koloně před vlastní mobilní fázi. Při výběru mezi THF a IPA je třeba vzít v úvahu jaký HPLC systém používáte. Pokud jsou hadičky systému nebo armatury vyrobeny z PEEKu, nelze použít THF, a proto je preferována IPA. Pokud je systém z nerezové oceli, lze použít THF nebo IPA. THF má výhodu nižší viskozity.Při kondicionování kolony pro použití v gradientovém systému je dobrou praxí propláchnout kolonu silným rozpouštědlem (obecně rozpouštědlem B) před ekvilibrací kolony v počátečním bodě gradientu. Pomůže to zajistit, aby kolona poskytovala dobrou základní linii při spuštění gradientu. Před nástřikem testovacího standardu je rovněž dobré udělat dva nebo tři slepé gradienty.Často vyvstává otázka: „Jak poznám, že je kolona plně kondicionována?“ Existují dva užitečné způsoby, jak to určit.<ul><li>Při použití UV detektoru by měla být základní linie (baseline) plochá. Obecně při změně složení rozpouštědla se základní linie bude svažovat. Její vyrovnání je dobrá známka toho, že kolona dosáhla rovnováhy s mobilní fází a je připravena k použití.</li><li>Zpětný tlak: Při výměně rozpouštědel, buď během kondicionování nové kolony, nebo na konci gradientu, se zpětný tlak měřený systémem změní. Postupem času se tlak stabilizuje, což ukazuje, že kolona je ekvilibrována. To může být užitečné při práci se systémy MS, kde obecně není sledována základní linie (baseline).</li></ul></div></div>

Kondicionování/aktivace HPLC kolon

Jednou z nejčastějších příčin krátké životnosti kolony je kontaminace kolony, která často vede k vysokému zpětnému tlaku a takzvané „ucpané“ vstupní fritě.Tento technický tip si klade za cíl vysvětlit, co se děje, a také jak se lze vyhnout kontaminaci kolony.Při výrobě kolon pro HPLC a UHPLC na bázi částic se frity používají k zabránění vstupu cizího materiálu do kolony a k zabránění tomu, aby náplň z HPLC kolon neunikala. Tyto frity jsou kotouče z porézního kovu, obecně o porozitě 0,5, 1,0 nebo 2,0 µm. Pokud vzorky obsahují nerozpuštěný materiál, bude odfiltrován z proudu rozpouštědla mobilní fáze, který se nachází na vnější straně vstupní frity. Jak tento proces pokračuje, dostupný povrch frity pro průchod mobilní fáze se zmenšuje, což omezuje tok mobilní faze a zvyšuje protitlak. Nakonec je téměř nemožné protlačit rozpouštědlo přes fritu a čerpadlo HPLC se vypne.Tomuto procesu lze zabránit filtrací vzorků před nástřikem do HPLC systému. Obecně se doporučuje používat 0,45 µm porézní <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/products/phenex-syringe-filters?_gl=1*befa9s*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*MTc0MjI4MDQ5NC4yLjAuMTc0MjI4MDQ5NC4wLjAuMA..">stříkačkové filtry </a>pro vzorky, které budou měřeny na 5 µm kolonách, 0,2 µm filtry pro 3 µm kolony a menší. Je třeba dbát na to, aby v ideálním případě rozpouštědlo přidávané ke vzorku odpovídalo mobilní fázi. Pokud tomu tak není, můžete se stát, že některé složky vzorku jsou rozpustné v rozpouštědle přidávaného ke vzorku, což jim umožňuje projít filtrem injekční stříkačky.Když jsou vstřikovány do mobilní fáze, mohou se vysrážet a způsobit ucpání frity. Tomu lze předejít buď rozpuštěním vzorku v mobilní fázi, nebo alternativně instalací vstupní frity nebo<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/products/securityguard-lc-guard-cartridge-system?_gl=1*1bfvfj1*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*MTc0MjI4MDQ5NC4yLjAuMTc0MjI4MDQ5NC4wLjAuMA.."> guard cartridge</a> jako spotřebního vyvení, aby se zabránilo znečištění vstupu kolony. &nbsp;<blockquote>Případně máme tento <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://app.explore.phenomenex.com/e/er?s=822460770&amp;lid=8337&amp;elqTrackId=7D1B2E6743B19B5717AFAEFF00F8A51C&amp;elq=00000000000000000000000000000000&amp;elqaid=4836&amp;elqat=2&amp;elqak=8AF5E09C05D0B7BFE5B44C560E3733C27992CF7C906A90E1BF5C55FDC1EA7D8B80B0&amp;_gl=1*1uyr77*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*MTc0MjI4MDQ5NC4yLjAuMTc0MjI4MDQ5NC4wLjAuMA..">webový nástroj</a>, který vás provede výběrem ochranné kazety.</blockquote>

Kontaminace kolon – jak k ní dochází a jak se jí lze vyhnout

<h4>Shrnutí</h4>Současná nová léčiva se z pohledu chromatografie vyznačují řadou výzev, ať už je to detekce nebo rozlišení od koelujících nečistot, nicméně největší překážkou bývá retence a rozlišení polárních sloučenin, které nejsou vhodné pro typické podmínky reverzní fáze C18.Mnoho tradičních stacionárních fází HPLC s reverzní fází neposkytuje dostatečnou retenci pro mnohé ze stále se zvyšujícího počtu polárních sloučenin analyzovaných pomocí HPLC. Tyto sloučeniny jsou často buď nezachyceny nebo je jejich retence nedostačující a tudíž je narušen tvar píku či koelují s jinými analyty se slabou retencí. Slabě zadržované analyty eluují v oblasti iontové suprese, což způsobuje problémy v rámci LC-MS analýzy.Tento technický tip představuje <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=347&amp;manufacturerItems=50">HILIC HPLC kolony</a> jako alternativní možnost, která je účinná zejména pro LC-MS. HILIC používá k eluci polárních sloučenin vysoké hladiny organického rozpouštědla, což pomáhá zlepšit jejich ionizační účinnost během LC-MS.<h5>Tip:&nbsp;</h5>HILIC funguje tak, že zadržuje polární sloučeniny ve vodní vrstvě, která se tvoří na povrchu silika částic (obr.1).<figure class="image"><img style="aspect-ratio:800/425;" src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Uspesne_technicke_reseni_analytickych_metod_pomoci_HILIC_jako_alternativniho_retencniho_mechanismu_bb362df4ea.jpg" alt="Phenomenex: Úspěšné technické řešení analytických metod pomocí HILIC jako alternativního retenčního mechanismu: Obr. 1" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Uspesne_technicke_reseni_analytickych_metod_pomoci_HILIC_jako_alternativniho_retencniho_mechanismu_bb362df4ea.jpg 245w," sizes="100vw" width="800" height="425"></figure><div>Acetonitril (MeCN) je slabé rozpouštědlo používané v HILIC a amonný pufr je rozpouštědlo silné. Amonné soli jsou zásadní jako protiionty usnadňující tvorbu dvojvrstvy důležitou pro separaci, která je znázorněna na obr. 1.</div>Polární stacionární fáze přitahuje vodní vrstvu čímž podporuje retenci polárních sloučenin. Polární sloučeniny se eluují se zvyšujícím se množstvím vody, což narušuje retenci polárních analytů k polární stacionární fázi, nezbytné k vyvolání eluce.Je důležité před použitím HILIC kolonu prvně ekvilibrovat, abychom zajistili dostačný čas k vytovření vodní vrstvy. Pokud nedojde k její tvorbě, tak retence bude nekonzistentí a metoda nebude dostatečně robustní.Zmínili jsme použití amonných pufrů, ale v rámci metody HILIC však existuje několik dalších faktorů, které jsou stejně zásadní pro její úspěch.První je selektivita, pro kterou je klíčová spravná volba kolony. Stejně jako u kolon s reverzní fází existuje pro HILIC mnoho různých stacionárních fází a každá z nich se vyznačuje různou selektivitou a dalšími benefity. Doporučujeme Vám vždy prověřit 3 různé fáze, abyste se ujistili, která nabízí nejlepší selektivitu pro Vaši aplikaci.<h5>Mezi HILIC stacionární fáze, které byste mohli zvážit, patří:</h5><ul><li>nemodifikovaná silika jako <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=347&amp;manufacturerItems=50&amp;search=Kinetex">Kinetex HILIC</a></li><li>diolové fáze jako <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=347&amp;manufacturerItems=50&amp;search=Luna">Luna HILIC</a></li><li>NH2 fáze</li><li>iontové / zwitteriontové</li></ul>Pokud jde o mobilní fázi, je důležité použít MeCN jako organickou složku - protická rozpouštědla, jako je methanol, mohou narušit dvouvrstvou formaci, o které jsme mluvili. Důležité je také množství organické složky, jejiž příliš vysoké procento v počátečním gradientovém bodě zkomplikuje a prodlouží ekvilibraci dvouvrstvy; 90% organické složky je pro začátek ideální.Pokud je to možné, tak gradientový profil by měl být 90% MeCN - 50%. Tímto způsobem lze zajistit plnou ekvilibraci na začátku gradientu. Pokud jsou k eluci sloučeniny vyžadovány podmínky větší než 50% pufru, bude lepší volbou polární typ C18 stacionární fáze, nikoliv HILIC. Po každém gradientu je nutná ekvilibrace dvouvrstvy. Čím vyšší je procento pufru na konci gradientu, tím delší bude proces ekvilibrace. Nedostatečná ekvilibrace bude mít za následek zhoršenou reprodukovatelnost a metoda nebude dostatečně robustní.Posledním parametrem, který je potřeba vzít v úvahu, je pH. Měly by být testovány nejméně 2 různé hodnoty pH. Obvykle se doporučuje pH 3.2 s použitím mravenčanu amonného a 5.8 s použitím acetátu amonného. Různé hodnoty pH mohou vést k výrazně odlišným selektivitám (obr. 2).<div><figure class="image"><img style="aspect-ratio:940/317;" src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Uspesne_technicke_reseni_analytickych_metod_pomoci_HILIC_jako_alternativniho_retencniho_mechanismu_2_cfa1c4dd2b.jpg" alt="Phenomenex: Úspěšné technické řešení analytických metod pomocí HILIC jako alternativního retenčního mechanismu: Obr. 2 Zásadní rozdíly v eluci v závislosti na typu mobilní a stacionární fázi." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Uspesne_technicke_reseni_analytickych_metod_pomoci_HILIC_jako_alternativniho_retencniho_mechanismu_2_cfa1c4dd2b.jpg 245w," sizes="100vw" width="940" height="317"></figure>HILIC je mimořádně užitečný nástroj pro zlepšení retence polárních sloučenin. Tato technika patří k náročnějším pokud jde o robustnost metody, nicméně pečlivá volba mobilní fáze a parametrů metody může vést k úspěšným separacím i náročnějších sloučenin.</div>

Úspěšné technické řešení analytických metod pomocí HILIC jako alternativního retenčního mechanismu

Při hodnocení dat z HPLC analýzy se pozornost obvykle soustředí na retenční čas, asymetrii píku a účinnost. Tyto parametry umožňují identifikaci a kvantifikaci analytů – čím přesnější jsou tyto informace, tím vyšší je spolehlivost identifikace píku a koncentrace analytu.Kapacitní faktor bývá často opomíjeným parametrem separací, avšak při správném využití může výrazně přispět k vývoji robustnější analytické metody. Kapacitní faktor normalizuje retenční čas analytu vzhledem k rozměrům chromatografické kolony a je definován vztahem:<h5 style="text-align:center;">K' = (tᵣ − t₀) / t₀</h5>kde tᵣ je retenční čas analytu a t₀ je retenční čas nezadržované sloučeniny.Význam kapacitního faktoru lze nejlépe demonstrovat na příkladu:<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_2_f6553ef593.jpg" alt="Phenomenex: Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody? 1. Kyselina šťavelová, 2. Kyselina vinná, 3. Kyselina glykolová, 4. Kyselina mravenčí, 5. Kyselina pyrohroznová, 6. Kyselina malonová, 7. Kyselina octová, 8. Kyselina maleinová, 9. Kyselina citronová." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_2_f6553ef593.jpg 245w," sizes="100vw" width="547" height="345">Zde máme separaci organických kyselin provedenou na koloně C18, která je stabilní až do 100% vodného prostředí. Mobilní fází je 20 mM fosfátový pufr o pH 2,9 s průtokem 0,7 ml/min. Na první pohled se zdá, že retence kyseliny šťavelové je téměř 4 minuty, ale při bližším pohledu je t₀ pro tuto kolonu přibližně 3,7 minuty. Pokud toto zohledníme, je zřejmé, že kyselina šťavelová – velmi polární dikyselina – nevykazuje prakticky žádnou retenci.<h5 style="text-align:center;">K' = (3,9 – 3,7) / 3,7 = 0,054</h5>To znamená, že kyselina šťavelová tráví během průchodu kolonou jen minimální čas ve stacionární fázi. V takových případech je retence analytu výrazně ovlivněna i drobnými, neúmyslnými změnami parametrů, jako jsou:<ul><li>složení mobilní fáze</li><li>pH mobilní fáze</li><li>síla rozpouštědla vzorku</li><li>teplota</li></ul>Taková metoda pravděpodobně nebude robustní, protože retence kyseliny šťavelové se bude lišit od jednoho běhu ke druhému, mezi různými kolonami nebo mezi šaržemi mobilní fáze.Z toho vyplývá doporučení, aby se při vývoji metod udržovaly kapacitní faktory v rozmezí 2–10. Viděli jsme potenciální problémy s kapacitními faktory menšími než 2, ale proč se zastavit právě na horní hranici 10?Při izokratické eluci se šířka píku zvyšuje s rostoucí retenční dobou vlivem difúze. Použití kolon s menšími částicemi a optimalizace průtoku může tento efekt částečně zmírnit, ale nelze jej zcela eliminovat. Navíc vysoké kapacitní faktory vedou k dlouhým retenčním časům, což je v rutinním laboratorním provozu obecně nežádoucí.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_22b7c55c44.jpg" alt="Phenomenex: Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody? 1. Hydrokortizon, 2. Kortikosteron, 3. 11-a-hydroxytestosteron, 4. Kortizon acetát, 5. 11-ketoprogesteron." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_22b7c55c44.jpg 245w," sizes="100vw" width="685" height="339">Zde máme příklad analýzy steroidů na koloně o rozměrech 150 × 4,6 mm při průtoku 1 ml/min. 11-etoprogesteron eluoval přibližně po 17,5 minutách s kapacitním faktorem přibližně 10,6. Za těchto podmínek izokratické eluce je patrné, že došlo k rozšíření píků, což naznačuje, že poslední eluující analyty jsou na koloně zadržovány příliš dlouho.Porozumění obecnému doporučení (kapacitní faktory mezi 2 a 10) je užitečné, ale zůstává otázkou, jak kapacitní faktor účinně upravit?Kapacitní faktor je nepřímo úměrný eluční síle mobilní fáze – vyšší eluční síla snižuje kapacitní faktor a naopak. Pokud nelze nízký kapacitní faktor zvýšit snížením eluční síly mobilní fáze, může být vhodné přejít na stacionární fázi, která nabízí vyšší retenci analytů, například zvolit polárnější stacionární fázi pro separaci polárních analytů.

Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody?

Jednou z nejčastějších příčin krátké životnosti kolony je její kontaminace, která často vede k vysokému protitlaku a takzvanému „ucpání“ vstupní frity.Tento technický tip má za cíl vysvětlit, co se při tom děje, a také jak lze kontaminaci kolony předcházet.Při výrobě HPLC a UHPLC kolon plněných částicemi se používají frity, které zabraňují vniknutí cizorodých látek do kolony a zároveň brání ztrátě stacionární fáze. Tyto frity jsou porézní kovové disky s velikostí pórů obvykle 0,5, 1,0 nebo 2,0 μm. Pokud vzorky obsahují nerozpuštěný materiál, zachytí se na vnější straně vstupní frity. Jak tento proces pokračuje, průtočná plocha frity se zmenšuje, což omezuje průtok mobilní fáze a tím dochází ke zvýšení protitlaku. Nakonec se stane nemožné protlačit rozpouštědlo fritou a HPLC čerpadlo se zastaví.Tomu lze předejít filtrací vzorků před vstřikováním do HPLC systému. Obecně se doporučuje používat stříkačkové filtry s porézností 0,45 μm pro vzorky analyzované na 5μm kolonách a 0,2 μm filtry pro 3μm kolony a menší. Je třeba dbát na to, aby rozpouštědlo vzorku ideálně odpovídalo mobilní fázi. Pokud tomu tak není, mohou být některé složky vzorku rozpustné v rozpouštědle a projdou tak filtrem. Při vstřiku do mobilní fáze se však mohou vysrážet a ucpat fritu. Tomu lze zabránit buď rozpuštěním vzorku přímo v mobilní fázi, nebo instalací vstupní frity či předkolony jako obětního prvku, který zabrání znečištění samotného vstupu kolony.Alternativně můžete využít i náš <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/tools/security-guard-selection#bybrand">webový nástroj</a>, který vás provede výběrem vhodné předkolony.

Kontaminace kolony – co se děje a jak tomu lze zabránit

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Společnost Phenomenex je celosvětovým technologickým lídrem, který se zabývá vývojem nových řešení v oblasti analytické chemie, jež řeší požadavky analytiků na separace a purifikace v průmyslových, vládních a akademických laboratořích.

Phenomenex

Moderní elektroanalytické metody (Cena Metrohm 2026)

ALS Kurz Analýzou HYDRAULICKÝCH a TURBÍNOVÝCH olejů k větší efektivitě výroby

Praktický kurz ŠKOLA HPLC

Big Scale, Big Wins: Prep Chromatography Explained

High-throughput stability screening strategies for antibody formulation

PFAS in Food & Food Contact Material