Kondicionování/aktivace HPLC kolon
- Foto: Phenomenex: Kondicionování/aktivace HPLC kolon.
- Video: Phenomenex: How to Clean an HPLC Column - Reverse Flush Method
Všechny HPLC kolony Phenomenex jsou před odesláním testovány v rámci kontroly kvality a uchovány v rozpouštědle, které je obecně stejné jako testovací rozpouštědlo, pokud není uvedeno jiné v CQA dokumentu dodávaném s kolonou.
„Kondicionování kolony“ nebo „aktivace“ jsou termíny, které se často používají zaměnitelně. Jednoduše řečeno se tak označují kroky, podniknuté ke změně rozpouštědla ve kterém je kolona uchována, na rozpouštědla specifická pro danou analytickou metodu.
Při zvažování, jaké kondicionování je nutné, je třeba věnovat pozornost následujícímu:
- Přepravní rozpouštědlo
- Požadovaná mobilní fáze pro analýzu
Je třeba zvážit následující otázky:
- Jsou tyto dva systémy rozpouštědel mísitelné?
- Obsahuje konečný systém rozpouštědel pufry, které se mohou vysrážet?
Phenomenex: Kinetex Core-Shell HPLC ColumnsPři práci s kolonami s reverzní fází, které se obvykle dodávají ve směsi acetonitril:voda v poměru 65:35 a obecně se používají se směsmi buď methanolu nebo acetonitrilu s vodou nebo pufrem, je často možné přejít přímo do plánované mobilní fáze. Pokud jsou koncentrace pufru vyšší než 20 mM, může být nutné nejprve přejít na nový poměr organiky a vody před přídavkem pufru, aby se snížilo jakékoli riziko vysrážení solí.
Malý počet stacionárních fází (kyano, amino, diol) může být použit v normální fázi nebo v reverzní fázi. Obvykle se dodávají ve směsích s normální fází, a pokud mají být použity za podmínek reverzní fáze, je vyžadována výměna přes univerzálně mísitelné rozpouštědlo, pro které lze použít následující protokol:
- Přepravní rozpouštědlo hexan:ACN v poměru 99:1
- Požadovaná mobilní fáze methanol:voda v poměru 50:50
- Propláchněte kolonu THF nebo IPA v množství 30 objemů kolony
- Propláchněte methanolem v množství 10 objemů kolony
- Propláchněte směsí methanol:voda v poměru 50:50, dokud nedosáhnete stabilní základní linie (baseline)
V tomto procesu se nejprve použije THF nebo IPA k odstranění hexanu z kolony. To je důležité, protože hexan se nemísí s methanolem ani vodou. Methanol pak nahradí THF nebo IPA v koloně před vlastní mobilní fázi. Při výběru mezi THF a IPA je třeba vzít v úvahu jaký HPLC systém používáte. Pokud jsou hadičky systému nebo armatury vyrobeny z PEEKu, nelze použít THF, a proto je preferována IPA. Pokud je systém z nerezové oceli, lze použít THF nebo IPA. THF má výhodu nižší viskozity.
Při kondicionování kolony pro použití v gradientovém systému je dobrou praxí propláchnout kolonu silným rozpouštědlem (obecně rozpouštědlem B) před ekvilibrací kolony v počátečním bodě gradientu. Pomůže to zajistit, aby kolona poskytovala dobrou základní linii při spuštění gradientu. Před nástřikem testovacího standardu je rovněž dobré udělat dva nebo tři slepé gradienty.
Často vyvstává otázka: „Jak poznám, že je kolona plně kondicionována?“ Existují dva užitečné způsoby, jak to určit.
- Při použití UV detektoru by měla být základní linie (baseline) plochá. Obecně při změně složení rozpouštědla se základní linie bude svažovat. Její vyrovnání je dobrá známka toho, že kolona dosáhla rovnováhy s mobilní fází a je připravena k použití.
- Zpětný tlak: Při výměně rozpouštědel, buď během kondicionování nové kolony, nebo na konci gradientu, se zpětný tlak měřený systémem změní. Postupem času se tlak stabilizuje, což ukazuje, že kolona je ekvilibrována. To může být užitečné při práci se systémy MS, kde obecně není sledována základní linie (baseline).
