Analysis of a Synthetic Peptide and Its Impurities

Význam tématu

Peptidová léčiva vyžadují přesné rozlišení a identifikaci vedlejších produktů syntézy a degradace. Klasické RP-HPLC metody s iontově párovacím TFA zlepšují separaci, avšak potlačují signál v LC/MS. Formiová kyselina (FA) je vhodnější pro MS detekci, ale na tradičních C18 kolonách vede často ke zhoršené separaci. Použití kolony Agilent AdvanceBio Peptide Plus umožňuje vysoké rozlišení peptidů s FA a snadný přenos metody mezi UV a MS detekcí.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout a ověřit LC metodu založenou na kolóně Agilent AdvanceBio Peptide Plus s 0,1 % FA jako modifikátorem mobilní fáze pro separaci syntetického peptidu bivalirudinu a jeho nečistot. Metoda měla zajistit ostré píky v LC/UV a zároveň identifikovat hlavní typy nečistot (delece, dehydrace, deamidace) pomocí LC/MS a MS/MS.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: syntetický bivalirudin (1 mg/mL v 0,1 % FA).
Provozní podmínky LC:

• Kolona: Agilent AdvanceBio Peptide Plus, 2.1×150 mm, 2.7 µm
• Mobilní fáze A: voda + 0,1 % FA; B: acetonitril + 0,1 % FA
• Gradient: 17 % B (0 min) – 37 % B (22 min) – 95 % B (24–26 min) – návrat na 17 % B (26,1 min)
• Průtok: 0,4 mL/min; teplota: 60 °C; injekční objem: 5 µL (UV), 1 µL (MS)
• Detekce UV: DAD (210 nm); MS: Agilent 6545XT LC/Q-TOF, pozitivní mód, rozmezí m/z 100–1700

Zpracování dat: OpenLab CDS pro UV, MassHunter BioConfirm pro MS/MS fragmentaci.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila oddělení pěti hlavních složek v chromatogramu UV a jejich identifikaci pomocí MS/MS s chybou <3 ppm:

• Peak 2: plnohodnotný produkt bivalirudinu (2178,99 Da)
• Peak 1: delece Glu (–129 Da)
• Peak 3: delece Gly (–57 Da)
• Peak 4: dehydrace ztrátou H₂O (–18 Da)
• Peak 5: deamidace Asn → Asp (+1 Da)

Kolona AdvanceBio Peptide Plus zajistila ostré a symetrické píky i při použití FA, přičemž byla zachována vysoká citlivost a selektivita v MS detekci.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednotná metoda pro UV i MS detekci usnadňuje validaci a přenos do QC laboratoří.
• Překonání omezení běžných C18 kolonií při použití FA jako iontově párovacího činidla.
• Rychlá a spolehlivá identifikace a kvantifikace nečistot syntetických peptidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na jiné terapeutické peptidy a proteinové fragmenty.
• Integrace s vysoce rozlišovacími MS technikami pro detailní charakterizaci modifikací.
• Automatizace a online monitoring kvality v průmyslové výrobě peptidů.

Závěr

Metoda založená na kolóně AdvanceBio Peptide Plus a FA jako modifikátoru mobilní fáze nabízí efektivní a citlivou analýzu syntetického bivalirudinu a jeho nečistot. Snadný přenos mezi LC/UV a LC/MS detekcí, vysoké rozlišení a nízká chyba měření zajišťují robustnost pro QC aplikace.

Reference

1. Eggen I. et al. Control Strategies for Synthetic Therapeutic Peptide APIs Part III: Manufacturing Process Considerations. Pharm. Technol. 2014, 38(5).