Complete Analytical Workflows for GLP-1 Receptor Agonists

Význam tématu

Peptidová léčiva, zejména agonisté receptoru GLP-1, hrají klíčovou roli v terapii diabetu 2. typu a obezity. S rozvojem nových konjugátů a modifikací (acylace, PEGylace) roste i jejich komplexita a potřeba spolehlivých analytických metod. Kvalitní stanovení identity, čistoty a obsahu nečistot je zásadní pro bezpečnost, účinnost a regulatorní soulad těchto bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem kompendia a jednotlivých aplikačních poznámek je představit komplexní analytické workflow pro GLP-1 agonisty: od rychlého potvrzení molekulové hmotnosti, přes detailní charakterizaci nečistot až po kvantifikaci v biologických matricích. Blok aplikačních poznámek pokrývá: identifikační metody (LC/MS s dekonvolucí spekter), analýzu čistoty a nečistot (RPLC, IP-RPLC, 2D-LC), sekvenční validaci (MS/MS), purifikaci (RPLC na polymerních stacionárních fázích) a bioanalýzu (MRM na triple-quadrupolu).

Použitá metodika a instrumentace

• Kapalinová chromatografie s vysokým rozlišením (HPLC/UPLC) na zařízeních Agilent InfinityLab a 1290 Infinity II Bio
• Hmotnostní spektrometrie: jednotková (LC/MSD XT, Triple Quadrupole 6495D) i vysokého rozlišení (Q-TOF 6545XT)
• Dvourozměrná LC pro zvýšení separační kapacity (2D-LC se srdcovými řezy a ASM modulací)
• Spektrální dekonvoluce a automatizované reporty v OpenLab CDS 2.8
• Biokompatibilní tokové cesty pro analýzu peptidů bez adsorpce

Hlavní výsledky a diskuse

• Potvrzení molekulové hmotnosti peptidu (např. GIP-1, semaglutide) pomocí LC/MSD XT a dekonvolučního algoritmu v OpenLab CDS.
• Optimalizace separace semaglutidu za použití různých stacionárních fází (PLRP-S, AdvanceBio Peptide Plus, Polaris C18) a gradientních podmínek s TFA i formiátem.
• Kvantifikace tirzepatidu v plazmě s LOQ 0,025 ng/mL pomocí MRM na 6495D triple quadrupolu.
• Charakterizace nečistot vzniklých v forced-degradation studiích (oxidace, deamidace) s Q-TOF MS a dekonvolucí: identifikace mono-, di- a tri-oxidovaných forem.
• 2D-LC/MS umožnila rozdělení koelutujících nečistot semaglutidu a přesné stanovení jejich molárních hmotností.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizace reportů a dekonvoluce spekter zkracuje čas potřebný ke zpracování dat a minimalizuje chyby operátora.
• Kombinace RPLC a MS-přátelských mobile fází umožňuje spolehlivou identifikaci modifikací i při použití ion-pair reagentů.
• 2D-LC zvyšuje selektivitu pro komplexní směsi produkt- a procesních nečistot.
• MRM metody na triple quadrupolu poskytují vynikající senzitivitu pro bioanalýzy v biologických matricích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření 2D-LC metod na automatické multidimenzionální platformy pro vyšší vzorkovou průchodnost.
• Integrace umělé inteligence pro automatické vyhodnocování spektrální dekonvoluce a interpretaci PTM.
• Využití ion-mobility MS pro lepší rozlišení izobarů a strukturálních izomerů peptidů.
• Rozvoj vysoce výkonných MS kvadrupól-Orbitrap a Fourier-transform technologií pro nejvyšší přesnost hmotnosti.
• Online spojení LC/MS metod s bioaktivními assay pro přímou korelaci čistoty s biologickou aktivitou.

Závěr

Komplexní analytické workflow kombinující LC, 2D-LC a MS vysokého i jednotkového rozlišení poskytuje robustní nástroje pro charakterizaci a kvantifikaci GLP-1 peptidů a jejich nečistot. Automatizace veškerých kroků od správy metod až po reportování usnadňuje implementaci ve vývoji i rutinní kontrole kvality.

Reference

• A.J. Pereira et al. Peptide-based therapeutics: challenges and solutions. Medicinal Chemistry Research 33, 1275–1280 (2024).
• W. Xiao et al. Advance in peptide-based drug development: delivery platforms, therapeutics and vaccines. Signal Transduct Target Ther 10 (2025).
• M. Yu et al. Battle of GLP-1 delivery technologies. Adv Drug Deliv Rev 130, 113–130 (2018).
• K. Fosgerau, T. Hoffmann. Peptide therapeutics: current status and future directions. Drug Discov Today 20, 122–128 (2015).
• G. Rossino et al. Peptides as Therapeutic Agents: Challenges and Opportunities in the Green Transition Era. Molecules 28(20), 7165 (2023).
• K. Jones. Tools and Techniques for GLP-1 Analysis. LCGC International (2025).
• PepTherDia: Database of Peptide Therapeutics and Diagnostics (accessed July 2, 2025).
• G. Walsh, E. Walsh. Biopharmaceutical benchmarks 2022. Nat Biotechnol 40, 1722–1760 (2022).
• L. Wang et al. Therapeutic peptides: current applications and future directions. Signal Transduct Target Ther 7(1) 48 (2022).
• M. D’Hondt et al. Related impurities in peptide medicines. J Pharm Biomed Anal 101, 2–30 (2014).
• FDA. 100 Years of Insulin. FDA History Exhibits (2022).
• D. Yi, J.E. Mertz. Paul Berg and the origins of recombinant DNA. Cell 187, 1019–1023 (2024).
• EMA. Assessment report Ozempic variation. EMA, 2021.
• O. Al Musaimi. Unlocking the Potential of Retro-Inverso (RI) Peptides. Int J Pept Res Ther 30, 56 (2024).
• C.A. Rhodes et al. Bicyclic Peptides as Next-Generation Therapeutics. Chem Eur J 23, 12690–12703 (2017).
• R.A. Bottens, T. Yamada. Cell-Penetrating Peptides as Therapeutic and Diagnostic Agents. Cancers 14(22) (2022).
• P. Thongpon et al. Peptide-Based Nanoparticle for Tumor Therapy. Biomedicines 13 (2025).