An In‑Depth Analysis of Semaglutide, a Glucagon‑Like Peptide‑1 Receptor Agonist

Význam tématu

Peptidové bioterapeutika, jako je semaglutide, představují klíčovou třídu léků pro léčbu diabetu 2. typu a obezity. Díky modifikaci mastnou kyselinou semaglutide zvyšuje svou stabilitu a dlouhodobý účinek. Pro zabezpečení bezpečnosti a účinnosti je však zásadní přesně stanovit čistotu a identifikovat případné nečistoty či degradační produkty.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo porovnat různé iontově párkové reverzní chromatografické metody a chemie stacionárních fází při analýze semaglutidu. Hodnoceny byly variační gradienty organické fáze, použití trifluoroctové (TFA) vs. mravenčí kyseliny (FA) a sedm typů RP kolon. Dále byla validována sekvenční identifikace pomocí LC/MS.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza probíhala za použití gradientní RP-HPLC s iontově párkovým činidlem. Rozpouštědla:

• Eluent A1: voda + 0,1 % TFA
• Eluent B1: acetonitril + 0,1 % TFA
• Eluent A2: voda + 0,1 % FA
• Eluent B2: acetonitril + 0,1 % FA

Testovány byly tyto kolony:

• AdvanceBio Peptide Plus (2,7 µm, superfic. por., 4,6×150 mm)
• AdvanceBio Peptide Mapping (2,7 µm, superfic. por., 4,6×150 mm)
• PLRP-S 100 Å a 300 Å (8 µm, plně por., 4,6×250 mm)
• Polaris Amide C18, Polaris C18-A, Pursuit C18 (5 µm, plně por., 4,6×250 mm)

Instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity II LC (pumpa, autosampler, termostat, DAD)
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF
• Software: OpenLab 2.6, MassHunter B.09, BioConfirm 10.00

Vzorek semaglutidu (1 mg/mL) byl připraven v mobilní fázi A a část byla vystavena 85 °C po 60 min pro degradaci.

Hlavní výsledky a diskuse

Srovnání UV chromatogramů pro TFA ukázalo ostré a symetrické píky u všech kolon, přičemž PLRP-S s polymerní fází vykázal širší píky. Nejkratší retence měla AdvanceBio Peptide Plus díky nižší hustotě vazby. Při použití FA se objevily sekundární vazby vedoucí k dělení a prodloužení špičky na některých kolonách. AdvanceBio Peptide Plus, Polaris Amide C18 a Polaris C18-A s pozitivně nabitou vazbou zamezily nekontrolovaným interakcím a udržely dobrý tvar píku. Větší póry (300 Å) PLRP-S zlepšily rozlišení u modifikovaných peptidů. LC/MS na AdvanceBio Peptide Plus potvrdila molekulární hmotnost semaglutidu (4 113,58 Da) s vícenásobným nabitím ([M+3H]³⁺ až [M+6H]⁶⁺).

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaná IP-RP metoda zajišťuje spolehlivé oddělení semaglutidu a jeho degradovaných produktů, což je zásadní pro vývoj a kontrolu kvality peptidových léčiv. Použití mravenčí kyseliny umožňuje kompatibilní LC/MS analýzu bez výrazného kompromisu v rozlišení.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozvoj nových povrchových modifikací stacionárních fází pro eliminaci vedlejších interakcí a totéž vylepšení pro preparativní chromatografii. Dále se předpokládá širší nasazení vysokopropustných LC/MS řešení a udržitelných rozpouštědelných systémů.

Závěr

Správná volba chemie stacionární fáze a iontově párkového činidla výrazně zvyšuje selektivitu a spolehlivost analýzy semaglutidu. AdvanceBio Peptide Plus poskytuje nejlepší kompromis mezi rozlišením ve formě TFA i FA a je doporučena pro LC/MS identifikaci peptidů.

Reference

1. Tripodi A. A., Coffey A., An In-Depth Analysis of Semaglutide – Comparative IP-RP analytical outcomes using different column chemistries, Agilent Technologies Application Note 5994-7419EN, 2024.