Evaluation of Modern and Legacy HPLC Systems for the Size-Exclusion Analysis of Aggregation and Fragmentation in a Monoclonal Antibody Drug

Význam tématu

Size-exclusion chromatografie (SEC) je klíčová metoda pro charakterizaci monoklonálních protilátek, zejména pro sledování tvorby agregátů a fragmentů, které jsou kritickými parametry kvality (CQA) v biopreparátech. Agregace může vést k imunogenním reakcím a snížení účinnosti léku, zatímco fragmentace odráží stabilitu během výroby, formulace a skladování. Optimalizace chromatografického systému proto zásadně ovlivňuje spolehlivost a přesnost analýzy těchto biopharmaceutik.

Cíle a přehled studie

Studie porovnává tři HPLC systémy na analýzu SEC mAb: moderní Alliance iS Bio HPLC s biokompatibilními povrchy MaxPeak HPS, klasický Alliance e2695 a konkurenční bio-inertní systém (System Y). Cílem bylo kvantifikovat systémovou disperzi, tvar špiček a schopnost rozlišit vysokomolekulární (HMWS) a nízkomolekulární (LMWS) nečistoty na modelu proteinového standardu a u infliximabu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky:

• BEH™ 200 SEC Protein Standard Mix (rekonstituovaný, filtrován 0,2 µm)
• Infliximab (Remicade™), 10 mg/mL v roztoku fosfátového pufru

Podmínky SEC:

• Kolona XBridge™ Premier Protein SEC 4,6×300 mm, 250 Å, 2,5 µm
• Mobilní fáze: K2HPO4/KH2PO4, KCl, pH 6,2 (isokratický režim)
• Průtok 0,3 mL/min, teplota kolony ambient, vzorku 6 °C
• Detekce UV 280 nm
• Injekční objem 5 µL (protein standard), 10 µL (infliximab)

Chromatografické systémy:

• Alliance iS Bio HPLC System (MaxPeak HPS, bio-inertní průtok)
• Alliance e2695 HPLC System (legacy)
• Bio-inertní konkurenční systém Y

Sběr dat: Empower CDS (různé verze podle systému).

Hlavní výsledky a diskuse

Alliance iS Bio vykázal nejnižší 4σ systémovou disperzi, což se projevilo menším rozšířením špiček a nižším tailingem. U proteinového standardu došlo k výraznému zpřesnění retence jednotlivých komponent a vyššímu poměru výšky špičky k její šířce.
V případě infliximabu byla u systému iS Bio patrná téměř úplná regenerace základní linie před elucí LMWS, což dovolilo spolehlivé vyhodnocení fragmentačních špiček (0,2 % relativní plocha). Legacy systém e2695 tyto nízkomolekulární špičky pohltíl v důsledku výrazného tailingu monomeru, zatímco System Y jejich obsah nadsadil. Separace HMWS byla u systémů iS Bio a Y srovnatelná, u e2695 však docházelo k nižšímu číselnému poměru špička/údolí (P/V ~6,6).

Přínosy a praktické využití metody

• Přesnější stanovení agregátů a fragmentů u mAb díky nízké disperzi a redukovanému šíření špiček.
• Vyšší citlivost detekce LMWS umožňuje spolehlivý monitoring kritických nečistot.
• Biokompatibilní povrchy MaxPeak HPS snižují nespecifické adsorpce velkých proteinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další vývoj povrchových modifikací pro minimalizaci interakcí s biomolekulami.
• Integrace ultra-vyššího tlaku (UPLC) pro zkrácení analýz a lepší rozlišení.
• Automatizace a AI-řízená optimalizace metod pro vyšší throughput v biofarmaceutických laboratořích.
• Bezpečnostní a regulační prvky pro zajištění kvality CQA v kontinuální výrobě léčiv.

Závěr

Alliance iS Bio HPLC System s technologií MaxPeak HPS prokázal nejnižší systémovou disperzi a minimální šíření špiček při analýze SEC mAb. To vedlo k nejpřesnějšímu rozlišení a kvantifikaci agregátů i fragmentů oproti staršímu systému e2695 a konkurenčnímu bio-inertnímu zařízení. Pro monitoring CQA u monoklonálních protilátek představuje iS Bio ideální volbu.

Reference

1. Vázquez-Rey M., Lang D.A. Aggregates in Monoclonal Antibody Manufacturing Processes. Biotechnol. Bioeng. 108(7), 1494–1508 (2011).
2. Vlasak J., Ionescu R. Fragmentation of Monoclonal Antibodies. mAbs 3(3), 253–263 (2011).
3. Koza S.M., Reed C., Chen W. Evaluating the Impact of LC System Dispersion on the Size-Exclusion Chromatography Analysis of Proteins. 2019.
4. Koza S.M., Reed C.E., Chen W. Impact of LC System Dispersion on the Size-Exclusion Chromatography Analysis of Monoclonal IgG Antibody Aggregates and Fragments. Waters Application Note 720006336 (2019).