SIZE-EXCLUSION CHROMATOGRAPHY (SEC) OF PEPTIDES, PROTEINS, AND AAVs

Význam tématu

Size-exclusion chromatography (SEC), známá též jako gel-filtrační nebo gel-permeační chromatografie (GPC), je klíčová technika pro oddělování molekul na základě jejich velikosti či hydrodynamického poloměru v roztoku. V biotechnologii se používá hlavně pro kvantifikaci a charakterizaci agregátů proteinů a peptidů, v polymerním průmyslu pro stanovení distribuce molárních hmotností a složení makromolekul. Přes svou relativně nízkou separační kapacitu je SEC díky své prostotě, reprodukovatelnosti a citlivosti považována za „zlatý standard“ při hodnocení agregace bioterapeutik i polydisperzních syntetických materiálů.

Cíle a přehled studie

Tato studie shrnuje pokroky v oblasti SEC, které umožnily přechod od konvenčních kolonkách se 5–10 µm částicemi ke sloupcům s sub-2 µm sorbenty a k ultra-vysokotlaké LC (UHPLC). Cílem je představit vývoj stacionárních fází, úpravy povrchů, optimalizaci chromatografických systémů i detekčních technik, jež vedou k rychlejším, efektivnějším a citlivějším separacím proteinů i polymerů.

Použitá metodika a instrumentace

• Stacionární fáze:
  • Původní gely Sephadex (křížově vázaný dextran), Bio-Gel (polyakrylamid) či agaróza se používají dnes především pro nízkotlaké aplikace.
  • Porézní silica modifikovaná dioly (neutrální interakce s proteiny) a trimethylsilylem (TMS) pro non-polární polymery.
  • Hybridní organicko-anorganické částice BEH (bridged ethyl hybrid) s vysokou mechanickou stabilitou a nižší kyselostí povrchu, dostupné v 1,7 µm i 2,5 µm variantách.
• Chromatografické systémy:
  • UHPLC přístroje navržené pro minimální extra-kolonkové rozptylování: tmavé průtokové cesty, úzké kapiláry (≤ 0,005"), nízkoodpadišťové ventily a materiály pro biokompatibilitu (PEEK, MP35N, titan).
  • Systémy pro vysokotlakou aplikaci polymerních mobile fází (THF, DMSO) až do 1000 bar.
• Detektory:
  • UV detekce 214–220 nm (peptidový amide bond) a 260–280 nm (aromatické aminokyseliny, nukleové kyseliny).
  • Fluorescenční detekce pro vyšší citlivost a selektivitu proteinů v přítomnosti excipientů.
  • Refraktivní index (RI) pro sacharidy a polymery bez chromoforů.
  • Multi-úhlové světelné rozptyl (MALS) ve spojení s UV či RI pro přímé stanovení molární hmotnosti a tvaru makromolekul.
  • UHPLC-kompatibilní MALS a low-dispersion RI detektory (Wyatt μDAWN, miniDawn, Optilab).
  • Sekundární přídavná MS (ESI, MALDI) pro molekulární hmotnost a modifikace, především v režimech denaturujících i native (pH 5–7 buffer ammonium acetát) či off-line MALDI.

Hlavní výsledky a diskuse

• Teoretické základy: v SEC je retence řízena entropií (ΔH ≃ 0), retentní faktor KD = (VR–V0)/VI a volba středního pórového rozměru (KD ≈ 0,5) definuje rozsah molekulárních hmotností. Selektilita (slope log M vs. KD) se zlepšuje užší distribucí pórů a vyšším intrapartikulárním objemem.
• Útlum nežádoucích interakcí: soli (100–500 mM NaCl), pH (6,5–8), arginin (50–300 mM), chaotropní anionty (ClO4–) či organické přísady (5–10 % MeCN) minimalizují iontové a hydrofobní vedlejší jevy.
• Rychlost vs. rozlišení: podpora pro 1,7 µm BEH sloupce a UHPLC systémy umožňuje rychlé (≤ 5 min) separace proteinů a 2–3× kratší časy než u 5–10 µm sorbentů, se srovnatelnou efficiencí (plate counts > 20 000 pro mAb).
• Oligomery a polymery: UHPLC sloupce se 1,7 µm BEH C18 propůjčily separace polystyrenových oligomerů do 400 Da v < 2 min, s efficiencí až 230 000 plates/m.
• HMW polymery do ~2 MDa: prodejní UHPLC sloupce s BEH C18, 200 Å, 1,7 µm pro SEC rozliší nativní polymery až na řádu megadaltonů bez shear degradace až do 1000 bar a 0,2–1,0 mL/min.
• Dvoudimenzionální analýzy: kombinace LCCC × UHPLC-SEC (4,6 × 150 mm, 1,7 µm) umožňuje na-line separaci kopolymerů PMMA/PBMA v < 25 min při plošné průtoku až 2 mL/min.

Přínosy a praktické využití metody

• QC a stabilita bioterapeutik: rychlé a spolehlivé kvantitativní sledování agregace mAb, proteinů a peptidů v řízených výrobních a stabilizačních studiích.
• Procesní vývoj: screening buněčných linií, optimalizace purifikačních sekvencí (Protein A, ion-exchange, HIC, SEC).
• Formulace: hodnocení interakcí surfaktantů (polysorbáty) a proteinů pomocí kombinované UV a fluorescenční detekce.
• Proteomika: rychlá likvidace proteinů a bioaktivních směsí v top-down nebo middle-down proteomických strategiích, afinitní či funkční studie komplexů.
• Polymerní praxe: přesná distribuce molárních hmotností a složení makromolekul do stovek kDa v rutinním analytickém provozu, včetně GPC=SEC-MS profilingu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření UHPLC-SEC-MS a UHPLC-SEC-NMR pro komplexní charakterizace, včetně nízkodisperzních zářivkových zdrojů pro MS a vysokofrekvenčních přesných NMR: cílená identifikace modifikací a struktur makromolekul.
• Vývoj kolonek s hybridními monolitickými fázemi pro dálší zvýšení pórového objemu i minimalizaci systémového rozptylu.
• Automatizované 2D sekvenování (e.g. afFFF-SEC, SEC-HIC) pro detailní analýzu heterogenních proteinových a polymerních soustav v krátkém čase.
• In-line charakterizace polymerních a proteinových vzorků v on-line výrobcích a procesních linkách, s automatickou korekcí za změny viskozity a teploty.

Závěr

Využití sub-2 µm sorbentů a nízkoodpadišťových UHPLC systémů pro size-exclusion separace umožnilo dramatický nárůst rychlosti, rozlišení i citlivosti pro analýzu proteinů a polymerů. Moderní BEH hybridní částice a optimalizované chromatografické přístroje minimalizují sekundární interakce i systémové rozptyly, což otevírá nové možnosti v QC bioterapeutik, farmaceutickém i polymerním výzkumu a vývoji.

Reference

• Flodin P., Porath J., Gel Filtration: A Method for Desalting and Group Separation, Nature 183 (1959) 1657.
• Porath J., Flodin P., Gel Filtration of Proteins, Peptides and Amino Acids, Biochim. Biophys. Acta 39 (1960) 193–207.
• Striegel A.M., Yau W.W., Kirkland J.J., Bly D.D., Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography, Wiley 2009.
• Wyndham K.D. et al., Characterization of C18 HPLC Phases Based on Ethylene-Bridged Hybrid Particles, Anal. Chem. 75 (2003) 6781–6788.
• Bouvier E.S.P. et al., Advances in Size Characterization of Synthetic Polymers, HPLC Symposium (2013).
• Ricker D.R., Sandoval L.A., Fast, Reproducible SEC of Biological Macromolecules, J. Chromatogr. A 743 (1996) 43–50.
• Uliyanchenko E. et al., UHPLC-SEC of Proteins and Polymers, J. Chromatogr. A 1217 (2010) 5003–5010.
• Janco M. et al., UHPLC Columns with High Pore Volume for Polymers, J. Chromatogr. A 1218 (2011) 7072–7078.