ADVANCING ANALYTICAL APPROACHES FOR ROBUST EVALUATION OF LARGE MOLECULE BIOLOGICS USING LIQUID CHROMATOGRAPHY

Význam tématu

Analýza velkých biologických molekul, zejména monoklonálních protilátek, je klíčová pro zajištění kvality a bezpečnosti biotechnologických léčiv. Metody jako velikostní vylučovací chromatografie (SEC) a iontově výměnná chromatografie (IEX) umožňují sledovat agregaci, fragmentaci a varianty nabití, což je zásadní pro vývoj, výrobu a kontrolu stabilních biologik.

Cíle a přehled studie

Studie porovnává výkonnost tří HPLC systémů při analýze protilátky infliximab pomocí SEC a hodnotí robustnost platformy Alliance iS Bio pomocí 30denního testu IEX metodou s vysokou koncentrací soli. Cílem je ověřit systematickou přesnost, opakovatelnost a stabilitu retencí a ploch variant.

Použitá metodika a instrumentace

SEC metoda

• Systémy: Alliance iS Bio HPLC, Alliance e2695 HPLC, konkurenční Bio HPLC.
• Kolona: XBridge Premier Protein SEC, 4,6×300 mm, 250 Å, 2,5 μm.
• Mobilní fáze: 60,3 mM K₂HPO₄, 140,3 mM KH₂PO₄, 249,5 mM KCl, pH 6,2.
• Průtok: 0,3 mL/min, izokraticky.
• Teplota kolony: okolní teplota, vzorek při 6 °C, objem injekce 10 μL.

IEX metoda

• Systém: Alliance iS Bio HPLC.
• Kolona: BioResolve SCX mAb, 4,6×100 mm, 3 μm.
• Mobilní fáze: A – 100 mM MES, B – 100 mM MES + NaCl, C – 1 M NaCl, D – voda.
• Gradient: adaptivní solný gradient pokrývající procenta A–D dle časového programu.
• Průtok: 0,5 mL/min, teplota kolony 30 °C, vzorek při 6 °C, objem injekce 10 μL.

Hlavní výsledky a diskuse

SEC porovnání
Systém Alliance iS Bio prokázal nejnižší disperzi, nejostřejší tvar píků a nejlepší rozlišení mezi monomerem, vysokomolekulárními (HMWS) a nízkomolekulárními (LMWS) fragmenty. Relativní plošné podíly agregátů (0,47 %), monomeru (99,44 %) a fragmentů (0,09 %) byly ve srovnání s ostatními systémy vysoce přesné a reprodukovatelné.

IEX robustnost
Během 30denního testu s 1 290 injekcemi dosáhl systém Alliance iS Bio nízkých hodnot RSD (<1 % pro procentuální plošné podíly tří lysinových charge variant IgG, IgGK a IgGKK, <1,5 % pro retence). Varianty s kyselým a zásaditým nábojem zůstaly stabilní a opakovatelné.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší spolehlivost a reprodukovatelnost analýz biologik pro QC a vývoj.
• Rychlé odhalení agregace, degradace a variant nabití v průběhu stability i výrobního procesu.
• Možnost dlouhodobého monitorování bez významné driftu retencí či ploch.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšiřování aplikací pro komplexní charakterizaci biologik v reálném čase, integrace MS detekce pro potvrdivé analýzy variant a automatizace procesů pro vysokou propustnost dat v GMP prostředí. Kombinace více chromatografických technik a pokročilých datových analýz posune kontrolu kvality biologik na novou úroveň.

Závěr

Platforma Alliance iS Bio HPLC představuje vysoce přesné a robustní řešení pro analýzu monoklonálních protilátek metodami SEC a IEX. Nízká disperze a výborná opakovatelnost výsledků potvrzují její vhodnost pro rutinní i dlouhodobé monitorování stability a kvality biologických léčiv.

Reference

Studie Waters Corporation: Reed C. E. a kol. 2024 – Advancing analytical approaches for robust evaluation of large molecule biologics using liquid chromatography