Evaluating the Performance of the ACQUITY Arc Bio UHPLC System for the Size-Exclusion Chromatography Analysis of a Monoclonal Antibody

Význam tématu

Velmi jemné částice v kombinaci s vysokým tlakem umožňují dosáhnout vysoké účinnosti a rozlišení při separaci biomolekul na základě velikosti. Pro bioterapeutika jako monoklonální protilátky je kritické přesně stanovit podíl agregátů a fragmentů, které ovlivňují bezpečnost a účinnost léčivého přípravku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo srovnat výkonnost tří kapalinových chromatografických systémů – ACQUITY UPLC H-Class Bio, ACQUITY Arc Bio UHPLC a Alliance HPLC – při analýze monoklonální protilátky trastuzumab metodou velikostně vylučovací chromatografie. Hlavní zaměření spočívalo v hodnocení vlivu extra kolonové disperze na rozlišení vysokomolekulárních agregátů a nízkomolekulárních fragmentů.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza probíhala v následující konfiguraci

• ACQUITY UPLC H-Class Bio se spektrofotometrem TUV, kol. termostat CM-A
• ACQUITY Arc Bio UHPLC se spektrofotometrem UV/Vis 2489, kol. termostat CM-A
• Alliance HPLC se spektrofotometrem UV/Vis 2489
• Kolony ACQUITY UPLC Protein BEH SEC 200 Å 1,7 µm (4,6×30 cm) a XBridge Protein BEH SEC 200 Å 3,5 µm (7,8×30 cm), v jedné variantě dvě kolony XBridge v sérii (7,8×60 cm)
• Mobilní fáze pro trastuzumab: 25 mM NaH2PO4, 400 mM NaCl pH 7,2; pro standard BEH200: 100 mM NaH2PO4 pH 6,8
• Měření systémové disperze cukralkoufinálním rozpouštědlem acetonitril/voda 70/30
• Standardní směs proteinů BEH200 a vzorek trastuzumabu (Herceptin) po expiraci
• Software Empower 3 pro zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky ukazují obrácenou úměru mezi systémovou disperzí a kvalitou separace

• Disperze (5σ) v µL: ACQUITY UPLC H-Class Bio ~20, ACQUITY Arc Bio ~34, Alliance HPLC ~66
• Vyšší rozlišení a počet destiček (plate count) u systémů s nižší disperzí
• Standard BEH200: UPLC systém dosáhl ~66000 destiček, Arc Bio ~53000, Alliance ~41500
• Analýza trastuzumabu: všechny systémy určily podíl vysokomolekulárních agregátů
• Stanovení nízkomolekulárních fragmentů: pouze ACQUITY UPLC a Arc Bio s BEH 1,7 µm kol. rozlišily fragment od monomeru; XBridge 3,5 µm kol. vyžadovalo dva kusy v sérii, ale za cenu delší doby analýzy a vyšší spotřeby vzorku a mobilní fáze
• Kvantitativně byla zjištěna srovnatelná úroveň agregátů kolem 0,48–0,50 % a fragmentů 0,29–0,42 %, fragmenty nelze spolehlivě kvantifikovat při nedostatečném rozlišení

Přínosy a praktické využití metody

V praxi lze využít následující poznatky

• ACQUITY Arc Bio poskytuje kompromis mezi výkonností UPLC a biokompatibilitou HPLC díky korozivzdorné konstrukci
• Volba chromatografického systému ovlivňuje přesnost stanovení nízkomolekulárních fragmentů
• Zvýšení rozlišení pomocí tandemových kolon XBridge může být řešením, pokud není k dispozici UPLC kolona
• Nutné zvažovat požadavky na čas analýzy, spotřebu vzorku a mobilní fáze

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování v oblasti SEC analýzy bioterapeutik

• Další snižování extra kolonové disperze v systémech UHPLC
• Vývoj nových biokompatibilních materiálů pro kolony
• Integrované automatizované systémy pro přípravu vzorků
• Kombinace SEC s hmotnostní spektrometrií pro komplexní charakterizaci struktur

Závěr

Studie potvrdila klíčový vliv systémové disperze na kvalitu SEC separace monoklonálních protilátek. ACQUITY UPLC H-Class Bio dosahuje nejnižší disperze a nejvyššího rozlišení, ACQUITY Arc Bio představuje vhodnou alternativu s vyšší biokompatibilitou. Správná volba kolon a systému je zásadní pro spolehlivé sledování agregátů i fragmentů v rámci kontroly kvality bioterapeutik.

Reference

1. Hong P Koza S Bouvier ES A review size exclusion chromatography for the analysis of protein biotherapeutics and their aggregates Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies 2012 35 20 2923 2950
2. Bouvier ES Koza SM Advances in size exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC TrAC Trends in Analytical Chemistry 2014 63 85 94
3. Neue UD HPLC columns Theory Technology and Practice 1997