Impact of LC System Dispersion on the Size-Exclusion Chromatography Analysis of Monoclonal IgG Antibody Aggregates and Fragments: Selecting the Optimal Column for Your Method

Význam tématu

Size-exclusion chromatography (SEC) je klíčová pro kontrolu kvality bioterapeutik, zejména monoklonálních protilátek (mAb). Separace vysokomolekulárních agregátů (HMWS) a nízkomolekulárních fragmentů (LMWS) zajišťuje bezpečnost, účinnost a stabilitu léčiv. Zvýšené nároky na přesnost kvantifikace fragmentů (např. hmota kolem 100 kDa) vyžadují optimalizaci chromatografického systému včetně minimalizace systémové disperze.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo systematicky analyzovat vliv extra-column dispersion na rozlišení a kvantifikaci HMWS a LMWS monoklonálních IgG protilátek. Studie porovnala SEC kolony s různou velikostí částic (1,7 µm, 2,5 µm, 3,5 µm), vnitřním průměrem 4,6 mm a 7,8 mm a délkou 150 mm či 300 mm. Hodnocena byla výkonnost na LC systémech s různými hodnotami 5σ systémové disperze.

Použitá metodika a instrumentace

Ultrarychlé a vysokotlaké LC systémy

• ACQUITY UPLC H-Class Bio
• ACQUITY Arc Bio
• Alliance HPLC

Kolony

• ACQUITY UPLC Protein BEH SEC 200 Å (1,7 µm)
• XBridge Protein BEH SEC 200 Å (2,5 µm, 3,5 µm)
• BEH SEC 200 Å vlastnoručně balené (3,5 µm)

Detekce a data

• UV detektor TUV při 280 nm
• Software Empower 3

Podmínky mobilní fáze

Složení: fosfátový pufr s NaCl (pH≈6,8–7,2); průtok a objem injekce upraven podle ID kolony.

Hlavní výsledky a diskuse

Měření systémové disperze pomocí 5σec (šířka píku při 4,4 % výšky) prokázalo asymetrické rozšiřování. Zvýšení 5σec vedlo k poklesu rozlišení, zvláště u fragmentů LMWS1, které elutují jako rameno hlavní monomerní špičky.
Pro HMWS (≈300 kDa) zůstalo rozlišení stabilní na většině kolonu za podmínky Rs>1,6. Rozlišení LMWS1 (≈100 kDa) nejvíce závisí na poměru objemu píku k objemu disperze:

• Kolona 4,6×300 mm (1,7 µm) dosáhla nejvyššího rozlišení při 5σec≤25 µl (P/V≈1,3–1,6). Při vyšší disperzi výrazně klesá.
• Kolona 7,8×300 mm (2,5 µm) poskytla stabilní rozlišení i při 5σec až 45 µl a méně závisí na disperzi; dosahuje srovnatelné nebo lepší P/V než 1,7 µm kolona na střední disperzi.
• Kolona 7,8×300 mm (3,5 µm) vykázala nižší rozlišení LMWS1, ale nejnižší tlak – vhodné pro systémy s omezenou kapacitou tlaku.

Strategie pro lepší rozlišení zahrnují prodloužení kolony (300→600 mm), snížení průtoku nebo zapojení dvou kolonu v sérii. Kompromis mezi časem analýzy, objemem mobilní fáze a citlivostí je klíčový.

Přínosy a praktické využití metody

Studie poskytuje konkrétní doporučení pro volbu SEC kolony na základě měřené hodnoty 5σ systémové disperze:

• 5σ≤12 µl: kolona 4,6×300 mm (1,7 µm)
• 12–25 µl: 4,6×300 mm (1,7 µm) nebo 7,8×300 mm (2,5 µm)
• 25–45 µl: 7,8×300 mm (2,5 µm)
• >45 µl: 7,8×300 mm (2,5 µm) nebo 7,8×300 mm (3,5 µm) pro nižší tlak

Možnost přenosu metod mezi systémy s různou disperzí zajišťuje vyšší robustnost analýz v QA/QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vzestup 2,5 µm BEH SEC materiálů kombinuje vyšší rozlišení se snazším provozem na středně disperzních systémech. Očekává se rozšíření kolonu s větší délkou, automatická kompenzace disperze a optimalizace pro vysokopropustné screeningové aplikace. Doporučuje se soustavné měření disperze a její zapojení do validace SEC metod i pro jiné třídy proteinů.

Závěr

Metoda zdůrazňuje nezbytnost sladění systémové disperze LC a konstrukce kolony pro spolehlivou analýzu mAb agregátů a fragmentů. Správná volba částic, ID a délky kolony minimalizuje vliv disperze a umožňuje reprodukovatelné kvantifikace nízkých podílů LMWS.

Reference

1. Hong P et al Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates J Liq Chrom Rel Technol 2012 35 2923–50
2. Cordoba AJ et al Non-Enzymatic Hinge Region Fragmentation of Antibodies J Chromatogr B 2005 818 115–21
3. Goyon A et al The importance of System Band Broadening in Modern Size Exclusion Chromatography J Pharm Biomed Anal 2017 135 50–60
4. Smith MA et al Specific Cleavage of Immunoglobulin G by Copper Ions Int J Pept Protein Res 1996 48 48–55