Analysis of N-glycans from Ribonuclease B

Význam tématu

Analýza N-vazebných glykánů je zásadní pro pochopení strukturálních a funkčních vlastností glykoproteinů v biotechnologii, medicíně a glykomické vědě. Precizní stanovení glykanových variant z modelové ribonukleázy B přispívá k vývoji kvalitních bioterapeutik a monitorování biologických vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo optimalizovat chromatografickou separaci a hmotnostně spektrometrickou detekci 2-aminobenzamidově (2-AB) značených N-glykanů (Man5–Man9) izolovaných z ribonukleázy B. Studie demonstruje využití HILIC kolony Shim-pack GIST Amide v kombinaci s vysoce rozlišeným LC-MS systémem Nexera X2/LCMS-9030.

Použitá metodika a instrumentace

V metodice byla aplikována hydrophilní interakční chromatografie (HILIC) na kolóně Shim-pack GIST-HP Amide za teploty 45 °C s gradientem acetonitrilu a amonného formiátu. Detekce probíhala dvěma kanály:

• Fluorescenční detekce (Ex 330 nm / Em 420 nm) pro citlivé sledování 2-AB glykanů.
• MS detekce v režimu pozitivní ESI, rozsah m/z 700–2500 na LCMS-9030.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatogramy prokázaly baseline separaci píků odpovídajících Man5 až Man9. Fluorescenční detekce poskytla vysokou citlivost a rozlišení jednotlivých izomerů, zatímco MS analýza potvrdila hmotnostní identitu glykánů. Diskuse zdůraznila vliv gradientu a teploty na rozlišení a reproducibilitu měření.

Přínosy a praktické využití metody

Tato kombinace HILIC a vysoce rozlišené MS umožňuje:

• Spolehlivou kvantifikaci N-glykanů v komplexních vzorcích.
• Sledování kvality bioterapeutik na úrovni glykosylace.
• Rozšíření glykomické charakterizace v akademickém i průmyslovém prostředí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další vývoj v oblasti:

• Miniaturizace HILIC kol ve spojení s kapilárními MS systémy pro zvýšení citlivosti.
• Integrace AI nástrojů pro automatizovanou interpretaci glykomických dat.
• Rozšíření aplikací na klinické glyko-metry a personalizovanou medicínu.

Závěr

Navržená metoda nabízí robustní platformu pro detailní analýzu N-vazebných glykánů pomocí HILIC LC-MS, s vysokým rozlišením, citlivostí a reprodukovatelností vhodnou pro biotechnologický výzkum i kontrolu kvality.

Reference

Shimadzu Corporation. ERAS-1000-0001A: Analysis of N-glycans from Ribonuclease B by HILIC LC-MS. First Edition, August 2021.