Analysis of glycan Shim-pack GIST-HP Amide (Metal free)

Význam tématu

Analýza glykanových struktur je klíčová pro charakterizaci glykosylace terapeutických protilátek. Rozdílné glykoformy ovlivňují biologickou aktivitu, stabilitu a imunogenicitu bioléčiv. Hydrofobně interakční chromatografie (HILIC) přináší vysoké rozlišení polárních sacharidů, což umožňuje přesnou kvantifikaci a kontrolu kvality.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyhodnotit výkon HILIC separace na metal-free sloupci Shim-pack GIST-HP Amide pro rozlišení osmi hlavních N-glykanů odvozených z protilátek. Studie demonstruje schopnost metody dosáhnout reprodukovatelného rozlišení a citlivé detekce fluorescenčně značených sacharidů.

Použitá metodika a instrumentace

Popis metodiky:

• Kapalinová chromatografie (Nexera XR)
• Sloupec: Shim-pack GIST-HP Amide [Metal free], 100 mm × 2,1 mm I.D., 1,9 µm (P/N 227-30951-02)
• Mobilní fáze A: 100 mM ammonium formiát, pH 4,4
• Mobilní fáze B: Acetonitril
• Gradient: 78 % B (0 min) → 69 % B (50 min) → 50 % B (50,01–55 min) → 78 % B (55,01–62 min)
• Teplota kolony: 40 °C
• Průtok: 0,5 mL/min
• Objem injekce: 1 µL
• Detekce: Fluorescenční (Ex 330 nm, Em 420 nm) pomocí RF-20Axs se semi-mikro kyvetou

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila oddělit osm glykanů s dobrým rozlišením během 62 minut. Baseline separace byla pozorována pro všechny testované sacharidy: G0-GN, G0, G0F, Man5, G1, G1F, Man6 a G2Ft. Metal-free konstrukce sloupce minimalizovala interakce se silylovými skupinami a zlepšila ostrost píků.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje:

• Vysokou selektivitu pro polární glykanové struktury
• Opakovatelnost retencí a velikosti píků v rámci QC laboratoří
• Citlivou fluorescenční detekci pro nízké koncentrace derivátů
• Kompatibilitu s metal-free technologií pro sníženou kontaminaci kovovými ionty

Budoucí trendy a možnosti využití

Budoucí směry zahrnují zkrácení doby analýzy pomocí rychlejších gradientů, nasazení mikro- a nanoprůtokových systémů pro vyšší citlivost, kombinaci s hmotnostní spektrometrií pro identifikaci glykanových izomerů a automatizaci datové analýzy pro vysokopropustné testování.

Závěr

Studie prokázala, že HILIC separace na metal-free sloupci Shim-pack GIST-HP Amide je spolehlivá a citlivá metoda pro kvalitativní i kvantitativní analýzu glykanů v protilátkách. Díky robustní konstrukci a všestrannosti je metoda vhodná pro rutinní nasazení v QC laboratořích biotechnologických společností.

Reference

• Shimadzu Corporation: Application News 01-00728 (JP, ENG), First Edition Sep. 2024