Quantitative Analysis of Methylmalonic Acid in Plasma Using a Q Exactive Focus High-Resolution Mass Spectrometer for Clinical Research

Význam tématu

Stanovení methylmalonové kyseliny (MMA) v plazmě je klíčové pro diagnostiku a monitorování poruch vitaminu B12 a dalších metabolických onemocnění. Vyžaduje vysokou citlivost a selektivitu, protože MMA je přítomna v nízkých koncentracích a je strukturálně podobná succinátové kyselině (SA), která může interferovat s analýzou.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a validovat kvantitativní metodiku pro měření MMA v lidské plazmě s využitím vysokorozlišeního Q Exactive Focus orbitrapového spektrometru. Studie hodnotila rozsah stanovení, přesnost, přesnost opakování, vliv matrice a robustnost metody.

Použitá instrumentace

• Orbitrapový spektrometr Q Exactive Focus s Ion Max APCI zdrojem
• Ultra-vysokotlaká kapalinová chromatografie UltiMate 3000RS s OAS autosamplerem
• Kolona Accucore C8 (2,6 µm, 50 x 2,1 mm)
• Software TraceFinder pro akvizici a zpracování dat

Použitá metodika

Příprava vzorku: plazma byla doplněna interním standardem D3-MMA, proteiny vysráženy, extrakt odpařen a analyty derivatizovány na dibutylestery MMA a SA za optimalizovaných podmínek během 20 minut.

Chromatografie: analyty byly separovány na C8 kolóně během 2,8minutové eluce s mobilními fázemi 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě a v methanolu.

Hmotnostní spektrometrie: měření v režimu paralelního reakčního monitoringu (PRM) s izolační šířkou 2,0 m/z, kolizní energií HCD a detekcí produktových iontů při rozlišení 70 000 FWHM. Pro kvantifikaci a potvrzení byly vybrány příslušné kvantifikační a kvalifikační fragmenty s přesností hmotnosti 5 ppm.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala rozsah stanovení 25–100 000 nM MMA s dolní mezí kvantifikace 25 nM. Lineární kalibrační křivka dosáhla korelačního koeficientu 0,9996. Intra-denní přesnost (%RSD) byla <1,5 %, mezidenní <1,4 %. Obnova v kontrolních vzorcích se pohybovala mezi 91,8 a 103 %. Efekt matrice byl minimální (obnova interního standardu 95,4–102 %). Krátký doba analýzy a vysoká selektivita umožňují vysoce efektivní provoz.

Přínosy a praktické využití metody

Díky rychlé přípravě vzorku a analytické době pod 3 minuty lze analyzovat až 50 vzorků za hodinu. Metoda je vhodná pro klinické výzkumné laboratoře i pro rozšíření na další metabolity s vysokorozlišením.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat multiplexní analýzu souboru biomarkerů, automatizaci přípravy vzorků a integraci s čtyřkanálovými LC systémy pro zvýšení propustnosti a datové kvality v preklinických i klinických studiích.

Závěr

Validovaná metoda na Q Exactive Focus prokázala vysokou citlivost, přesnost a odolnost vůči matici při stanovení MMA v plazmě. Rychlá analýza a minimální nároky na přípravu vzorku podporují její využití v klinickém výzkumu.

Reference

1. Mindy Gao, Joe Di Bussolo, Marta Kozak. Quantitative Analysis of Methylmalonic Acid in Plasma Using a Q Exactive Focus High-Resolution Mass Spectrometer for Clinical Research. Thermo Fisher Scientific, Application Note 654, 2016.