Clinical research and forensic toxicology - Application Compendium

Význam tématu

V klinickém výzkumu je klíčové přesně a citlivě kvantifikovat endokrinní a terapeutické látky v biologických matricích. Moderní metody kapalinové chromatografie spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) poskytují vynikající selektivitu a citlivost, ale vyžadují optimální přípravu vzorků a separaci, aby se potlačily interferující matricové složky, zejména fosfolipidy a podobné nečistoty.

Cíle a přehled studie / článku

Výzkumné práce předkládané v tomto přehledu demonstrují vývoj a validaci metod LC-MS/MS pro široké spektrum analytů: od 25-hydroxyvitaminu D, 1,25-dihydroxyvitaminu D, metanefrinů a steroidních hormonů (estron, estradiol, testosteron, kortisol) až po parathormon (PTH) a imunokosupresiva. Cílem bylo dosáhnout nízkých detekčních a kvantifikačních limitů v rozsahu pg/mL, vynikající lineárity, přesnosti a reprodukovatelnosti a zároveň zkrátit dobu analýzy a minimalizovat spotřebu organických rozpouštědel.

Použitá metodika a instrumentace

• On-line příprava vzorku: TurboFlow™ SPE (Thermo Scientific) pro automatické odsolení, vysrážení proteinů a odstranění fosfolipidů bez offline extrakce.
• Imunoinflorescenční izolace: specifická extrakce PTH a 1,25-dihydroxyvitaminu D pomocí upravených ImmuTube® sloupců.
• Kapalinová chromatografie: krátké kolony Accucore C8, Hypersil GOLD či Hypercarb s filtrací na pevném jádru (solid core) o velikosti částic 1,9–3 µm; multidimenzionální („2D“) separace pro potlačení interferencí.
• Detekce: Triple quadrupole MS (TSQ Vantage, TSQ Quantum Ultra) v režimu SRM/MRM s APCI nebo HESI zdrojem; vysoké rozlišení a přesná hmotnost (Orbitrap Exactive Plus); FAIMS (Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry) pro další eliminační krok interferujících iontů.
• Software a kvantifikace: stabilně značené standardy, TraceFinder™ či Pinpoint™ pro řízení metody, výběr přechodů a výpočet obsahu analyzovaných látek.

Hlavní výsledky a diskuse

• Vitamin D (25-OH D2/D3): LLOQ 2 ng/mL, lineárnost do 100 ng/mL, CV <10 %, analýza za 7,75 min, automatická příprava. Vysoké rozlišení Orbitrapu eliminuje nečistoty a umožňuje full-scan vyhledávání nových variant.
• Metanefriny: IP-SPE + LC-MS/MS s PGC kolonu; LLOQ 6,3 pg/mL (metanefrin), 12,6 pg/mL (normetanefrin), lineárnost stovky pg/mL, CV <11 %.
• Steroidy (estron, estradiol): LLOQ 3,5–4,4 pg/mL bez derivatizace, 6min LC-APCI-MS/MS, CV <12 %. Testosteron: online TurboFlow extrakce a FAIMS, LLOQ 2,5 pg/mL, CV <10 %.
• PTH: MSImmunoanalyza SRM-MSIA s Orbitrap/LTQ pro PTH1–84 a varianty; citlivost v nízkých ng/mL, simultánní objev nových mikroheterogenit.
• 1,25-dihydroxyvitamin D: Imunoextrakce a APPI-LC-MS/MS, LLOQ 5 pg/mL pro D2 i D3, lineárnost do 200 pg/mL, CV <12 %.
• Imunokosupresiva (sirolimus, everolimus, tacrolimus, cyklosporin A): dual-channel TurboFlow-LC-MS/MS, LLOQ 2,5 ng/mL (sirolimus, everolimus, tacrolimus), 25 ng/mL (CyA), lineární rozsah do 50/1250 ng/mL, přesnost <10 %, throughput 21 vzorků/hod.
• Kortisol/kortison v moči: 10min HTLC-MS/MS, LLOQ 0,12/0,20 µg/dL, lineárnost 0,12–20 µg/dL, CV intra/inter <20 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Kompletní automatizace přípravy vzorků eliminuje manuální operace a snižuje riziko kontaminace.
• On-line SPE a multidimenzionální LC redukují potřebu offline SPE/LLE, zčasťují spotřebu rozpouštědel a snižují spotřebu těžko dostupných linií antikorů.
• Stable-isotope dilution zajišťuje kvantitativní přesnost i v přítomnosti mírných interferencí.
• High-res mass analyzátory (Orbitrap) a FAIMS přinášejí dodatečnou selektivitu konfirmace a možnost full-scan metabolomiky.
• Metody splňují požadavky klinického výzkumu na nízké limity kvantifikace, reprodukovatelnost a throughput.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšíření multiplexních LC systémů (TLX-4) pro vyšší propustnost až stovky vzorků za hodinu.
• Integrace inteligentního SI-MSIA režimu v biobankách a klinických laboratořích pro simultánní sledování více biomarkerů.
• Využití full-scan vysokého rozlišení a neuronových sítí pro neřízené objevování nových bioindikátorů a zpětnou konfirmaci.
• Nasazení miniaturizovaných či přenosných LC-MS/Mobile-MS pro ambulantní monitorování terapeutických hladin.

Závěr

Popisované LC-MS/MS metody využívající online SPE, imunoextrakci, turbo-flowsystémy, vysoké rozlišení a ion-mobility dosahují vysoké citlivosti a selektivity pro endokrinní a terapeutické látky. Automatizace, nízké LLOQ a robustnost umožňují jejich nasazení v klinickém výzkumu k přesnému monitorování hormonálních a léčebných parametrů.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific TSQ Vantage / Quantum Ultra (triple quadrupole MS/MS)
• Thermo Scientific Exactive Plus Orbitrap
• Thermo Scientific Prelude / Transcend TLX-1/2/4 (TurboFlow SPE-LC)
• Thermo Scientific Surveyor / Accela UHPLC
• Thermo Scientific Hypersil GOLD, Accucore C8/C18, Hypercarb™, Cyclone-P columns
• FAIMS interface

Reference

1. He X. a kol. Quantitative Measurement of Plasma Free Metanephrines…J. Chromatogr. B 2011.
2. Borges C.R. a kol. Full-length characterization of proteins in human populations…Clin. Chem. 2010.
3. Lopez M.F. a kol. Discovery and targeted SRM assay development…J. Proteome Res. 2011.
4. He X., Kozak M. Fast and Sensitive LC-APCI-MS/MS Quantitative Analysis of Estrone and Estradiol…Thermo Fisher Sci. App. Note 530 (2013).
5. He X., Yuan C., Kozak M. Sample preparation techniques…Thermo Fisher Sci. App. Note 567 (2013).
6. Olney T., Silivra O., Nguyen H. Development of a Method for Evaluation of MS Performance in Real Time…Thermo Fisher Sci. PN ASMS13_M003 (2013).