Fast and reliable method for the analysis of methylmalonic acid from human plasma

Význam tématu

Methylmalonová kyselina (MMA) je klíčový biomarker deficitu vitaminu B12. Přesná a rychlá detekce MMA v lidské plazmě umožňuje včasnou diagnostiku kobalaminové nedostatkovosti. Hlavní analytickou výzvou je rozlišení MMA od izobarické sukcinové kyseliny (SA), která má stejnou hmotnost a podobný fragmentační vzorec v MS detekci.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout vysoce propustnou přesnou metodu pro analýzu MMA v lidské plazmě kombinující mikroskalní SPE se smíšenou iontovou výměnou a rychlou LC-MS/MS analýzu. Metoda musí separovat MMA od sukcinové kyseliny a používat deuterovaný interní standard MMA-d3. Bylo též ověřeno použití fosfátového pufru (PBS) jako náhradní matrice pro kalibraci.

Použitá instrumentace

• SPE deska SOLAµ WAX (Thermo Scientific)
• LC systém Dionex UltiMate 3000 RSLC
• Analytický sloupec Acclaim Surfactant Plus 3 µm, 150×2,1 mm
• Guard kolona Hypersil GOLD 5 µm, 10×4 mm
• MS detektor Thermo Scientific TSQ Quantiva s HESI zdrojem v negativním módu
• Softwarové zpracování dat LCQUAN

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografická separace MMA (RT 2,37 min) a sukcinové kyseliny (RT 1,71 min) byla dosažena za 3,5 minuty. Lineárita v rozsahu 15–1200 ng/mL vykázala R2 = 0,9951 s vážením 1/x2. Objem eluce 100 µL a přímá injekce bez derivatizace umožnila zpracovat 96 vzorků během 1–2 hodin.
Obnova MMA z PBS se pohybovala mezi 91–96 %, z plazmy 81–105 %. Matricové potlačení bylo nízké (-4 až -10 % v PBS, -10 až -22 % v plazmě). Precision a accuracy QC vzorků v hladinách 25, 200 a 1000 ng/mL byly v rámci ±11 % biasu a RSD < 10 %. Endogenní hladina MMA v lidské plazmě činila v průměru 12,2 ng/mL (RSD 12 %).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí rychlou a robustní extrakci MMA z malého objemu plazmy bez potřeby časově náročné derivatizace. Vysoká reprodukovatelnost a nízké matrice efekty umožňují spolehlivou kalibraci v náhradní matrici a rutinní aplikaci v klinických i výzkumných laboratořích. Díky nízkým objemům eluce se zvyšuje citlivost a šetří se drahé handlings.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze dále automatizovat a rozšířit na analýzu dalších organických kyselin souvisejících s metabolickými poruchami. Miniaturizace a integrace s kapilárními systémy LC-MS by mohla podpořit point-of-care aplikace. Pokročilé datové algoritmy a umělá inteligence mohou zefektivnit vyhodnocování výsledků a zkrátit dobu analýzy.

Závěr

Popsaná LC-MS/MS metoda s mikroskalní smíšenou iontovou výměnou SPE je rychlá, přesná a selektivní pro stanovení MMA v lidské plazmě. Oddělení od sukcinové kyseliny v kratším čase než 4 minuty a minimální matrice efekty potvrzují vysokou spolehlivost pro klinickou i průmyslovou aplikaci.

Reference

• Bardsley J, Goldberg J. Fast and reliable method for the analysis of methylmalonic acid from human plasma. Thermo Fisher Scientific Application Note No. 21172; 2020.