Fast and Reliable Method for the Analysis of Methylmalonic Acid from Human Plasma

Význam tématu

Analýza methylmalonové kyseliny (MMA) v lidské plazmě je klíčová pro diagnostiku deficitů vitaminu B12, hodnocení funkce ledvin a monitorování metabolických poruch. Přesné a spolehlivé stanovení MMA vyžaduje eliminaci interferencí, zejména ze succinové kyseliny (SA), která má stejnou molekulární hmotnost a podobný fragmentační vzorec v hmotnostní spektrometrii.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout rychlou, citlivou a vysoce propustnou metodu pro stanovení MMA v plazmě pomocí mikro-mikroiontově selektivní extrakce (SPE) a LC-MS/MS. Metoda využívá deuterovaný interní standard pro korekci variabilit a zajišťuje chromatografickou separaci MMA od SA bez potřeby časově náročné derivatizace.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly zpracovány na 96jámkové mikro-destičce SOLAµ WAX (smíšená aniontová výměna). Po kondicionaci a naložení vzorku se provedlo vymytí amonným acetátem a eluční krok v nízkých objemech. Chromatografie probíhala na systému Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 RSLC s kolonkou Acclaim Surfactant Plus (3 µm, 150 × 2,1 mm) a ochranou Hypersil GOLD (5 µm, 10 × 4 mm). Mobilní fáze A: 15 mM amonný acetát pH 4; fáze B: acetonitril; gradient 20 → 95 % B za 3,6 min; průtok 0,45 mL/min; teplota kolonky 30 °C; injekce 15 µL. Detekce na Thermo Scientific TSQ Quantiva (HESI, negativní ionizace) sledovala přechody m/z 117→73 pro MMA a m/z 117→99 pro SA. Data zpracována v LCQUAN.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatograficky byla dosažena baseline separace SA (RT 1,71 min) a MMA (RT 2,37 min) během 3,5 minuty. Kalibrace pro MMA v rozsahu 15–1200 ng/mL vykázala linearitu R2 0,995. Přesnost (bias) se pohybovala v rozmezí ±11 %, opakovatelnost (% RSD) byla pod 10 %. Obnova MMA dosahovala 81–96 %, účinky matice byly v rozmezí –4 % až –22 %. Surrogátní matice (PBS) se ukázala jako vhodná náhrada pro přípravu standardů bez ztráty přesnosti.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká propustnost: až 96 vzorků během 1–2 hodin bez derivatizace.
• Nízké objemy elučních fází s minimální ztrátou analyzovaných látek.
• Spolehlivá separace MMA od SA zajišťuje vysokou selektivitu měření.
• Potenciál pro klinické laboratoře, výzkum i QA/QC procesy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování zahrnuje automatizaci přípravy vzorků v mikroplatech, vývoj nových sorbentů pro širší profilaci organických kyselin a integraci s vysokorychlostními hmotnostními spektrometry. Cloudové platformy pro analýzu dat podpoří rozšíření personalizované medicíny.

Závěr

Metoda založená na SOLAµ WAX SPE a rychlé LC-MS/MS analýze nabízí citlivé, přesné a efektivní stanovení MMA v plazmě s eliminací interference succinové kyseliny. Je vhodná pro klinické a výzkumné aplikace vyžadující vysokou spolehlivost a propustnost.

Reference

• Thermo Fisher Scientific. Application Note AN21172: Fast and Reliable Method for the Analysis of Methylmalonic Acid from Human Plasma. 2015.