Evaluation of Bench-top Quadrupole Orbitrap Ultra High Resolution MS for Use in Clinical Research in Rapid Quantitative Analysis of Vitamin D in Human Plasma

Význam tématu

Rychlé a spolehlivé stanovení 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 v lidské plazmě je klíčové pro klinický výzkum a monitorování stavu vitaminu D u pacientů. Niedostatek vitaminu D je spojen s řadou onemocnění, proto je potřeba citlivých a specifických analytických metod, které zvládnou vysokou přesnost i v komplexním biologickém matrice.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ověřit možnost využití bench-top Orbitrapového hmotnostního spektrometru (Thermo Scientific Q Exactive Focus) s vysokým rozlišením pro rychlou kvantifikaci 25OHD2 a 25OHD3 v lidské plazmě. Metoda kombinuje jednoduchou přípravu vzorku, tříminutovou chromatografii a paralelní monitorování fragmentů (PRM) pro zajištění vysoké specifičnosti a reprodukovatelnosti.

Použitá instrumentace

• LC systém: Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 pumpa a OAS-3X00TXRS autosampler
• Kolona: Thermo Scientific Hypersil GOLD aQ, 5 µm, 50 × 2.1 mm
• Mobilní fáze A: voda s 0.1 % kyselinou mravenčí; B: methanol s 0.1 % kyselinou mravenčí
• Hmotnostní spektrometr: Thermo Scientific Q Exactive Focus Orbitrap s APCI zdrojem
• Softwarové zpracování: TraceFinder 3.2

Použitá metodika

Vzorek byl připraven precipitací bílkovin acetonitrilem obsahujícím deuterovaný interní standard d6-25OHD3 (25 ng/mL). Po centrifugaci se 50 µL supernatantu injektovalo na LC-PRM systém. Gradientní eluce trvala 3 minuty. Pro kvantifikaci byly vybrány nejintenzivnější fragmenty (m/z 269.1893 pro 25OHD2, 257.2257 pro 25OHD3) při optimalizovaných kolizních energiích.

Hlavní výsledky a diskuse

• Lineární rozsah kalibrace: 4–100 ng/mL, koeficient lineárity R² > 0.995.
• Mezi-i nitrodialní přesnost a přesnost (%RSD, %recovery) všech QC úrovní byla lepší než 15 %.
• Maticové účinky byly minimální, u většiny donorů %RSD pod 10 % a recoverie mezi 80–110 %.
• Systémová reprodukovatelnost (5 replik kalibrantů) ukázala %RSD 1.6–4.7 % pro 25OHD2 a 1.4–3.9 % pro 25OHD3.
• Vysoké rozlišení MS² spektrometrie zabránilo zásadním interferencím a potvrdilo vysokou specifičnost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí velmi rychlé analýzy (3 minuty), snadnou přípravu vzorku a vysokou specifitu díky PRM experimentu. Je vhodná pro vysoce propustné laboratoře, klinické studie i kvalitativní kontrolu v biobance, kde se vyžaduje robustní a reprodukovatelná kvantifikace vitaminu D.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit o stanovení dalších vitaminových metabolitů (25OHD-epi izomery, 1,25-dihydroxyvitamin D) díky schopnosti Orbitrapu sbírat MS² spektra s vysokým rozlišením. V budoucnu se očekává implementace plně automatizované přípravy vzorků a využití více deuterovaných interních standardů pro korigování matrice specifických odchylek.

Závěr

Ověřená LC-PRM metoda na bench-top Orbitrapu splňuje požadavky klinického výzkumu na rychlou a přesnou kvantifikaci 25OHD2 a 25OHD3 v plazmě. Doporučený pracovní rozsah je 4–100 ng/mL a pro korekci maticových efektů se doporučuje použití deuterovaného standardu i pro 25OHD2.

Reference

• Gao M, Kozak M. Evaluation of Bench-top Quadrupole Orbitrap Ultra High Resolution MS for Use in Clinical Research in Rapid Quantitative Analysis of Vitamin D in Human Plasma. Thermo Fisher Scientific Poster Note PN64374, 2015.