Simultaneous Analysis of Cyclosporine, Everolimus, Sirolimus, and Tacrolimus in Whole Blood for Clinical Research

Význam tématu

Imunosupresivní léky cyklosporin, everolimus, sirolimus a takrolimus vykazují výraznou inter- i intraindividuální variabilitu farmakokinetiky. Přesná a citlivá kvantifikace v krvi je klíčová pro výzkum farmakokinetických a farmakodynamických vlastností těchto látek, optimalizaci dávek a hodnocení biologické účinnosti v klinických studiích.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout rychlou, spolehlivou a vysoce selektivní metodu pro simultánní stanovení čtyř imunosupresiv v lidské celkové krvi s minimálním objemem vzorku. Studie představuje jednoduchou přípravu vzorku následovanou UPLC separací a MRM detekcí na tandemovém hmotnostním spektrometru.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: 50 µl celkové krve, precipitace bílkovin 0,1 M roztokem ZnSO4, přidání interních standardů v acetonitrilu, centrifugace a analýza supernatantu.
• Chromatografie: Waters ACQUITY UPLC I-Class s FL modulem; kolona HSS C18 SB (2,1×30 mm, 1,8 µm), teplota 55 °C; gradientní eluční cyklus 1,5 min (injekce-injekce 1,9 min); mobilní fáze voda a methanol s 2 mM acetátem amonným a 0,1 % kyseliny mravenčí; objem injekce 20 µl.
• Hmotnostní spektrometrie: Xevo TQ-S micro, ESI pozitivní režim, MRM akvizice se zvolenými přechody pro analyty i interní standardy, rozlišení MS1 a MS2 0,7 FWHM, teploty zdroje 120 °C, desolvatace 400 °C.
• Softwarové zpracování: MassLynx v4.2 s TargetLynx XS.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatogram kalibrátoru pro 25 ng/ml cyklosporinu a 1 ng/ml ostatních imunosupresiv vykázal ostré rezonance bez carry-over ani matriového rušení.
• Limit kvantifikace (LLOQ) byl stanoven při hodnotách umožňujících přesnost ≤20 % CV a bias ≤15 %.
• Celková preciznost a opakovatelnost (n=25) ve třech úrovních QC dosáhla RSD ≤8,4 %.
• Lineární odezva pro cyklosporin byla v rozmezí 19,3–1500 ng/ml a pro everolimus, sirolimus a takrolimus 0,77–39,0 ng/ml.
• Obnova extrakcí činila 93–108 %, matrix effect byl kompenzován interními standardy a post-column infusion potvrdil minimální ionizační supresi či enhancement.
• Diluce 1:1 pomocí blank krve umožnila přesnost bias ≤10,4 % pro vysoké koncentrace.
• Analýza EQA vzorků (LGC Bury, UK) prokázala dobrou shodu s all-laboratory trimmed mean.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje vysokou selektivitu díky UPLC-MS/MS, krátký analytický čas pod dvě minuty, minimální spotřebu vzorku (50 µl) a jednoduchou, ekonomickou přípravu. Je vhodná pro farmakokinetické studie, monitorování lékové terapeutiky v klinickém výzkumu i vývoj nových imunosupresivních režimů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu analyzovaných látek o další imunosupresiva či jejich metabolity.
• Automatizace přípravy vzorků a integrace s robotickými platformami pro vysokoprodukční screening.
• Využití pokročilých datových analýz a strojového učení pro predikci farmakokinetických parametrů.
• Možné přenesení metody do diagnostických laboratoří pro terapeutické drug monitoring.

Závěr

Vyvinutá UPLC-MS/MS metoda umožňuje spolehlivé simultánní stanovení čtyř klíčových imunosupresiv v lidské krvi s vysokou přesností, precizností a nízkým nárokem na objem vzorku. Rychlá analýza a robustní výkon podporují její využití v klinickém výzkumu a terapeutickém monitorování.

Reference

1. Crossart A, Isbel M, Schuder C, Campbell SB, Staatz CE. Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Considerations in Relation to Calcineurin Usage in Elderly Kidney Transplant Recipients. Frontiers in Pharmacology. 2021;12:635165.