Expanding Size-Exclusion Chromatography Platform Method Versatility for Monoclonal Antibody Analysis Using Waters XBridge Premier Protein SEC Columns

Význam tématu

Therapeutické monoklonální protilátky (mAb) mohou obsahovat agregáty a fragmenty, které negativně ovlivňují jejich účinnost i bezpečnost. Analýza velikostních variant pomocí chromatografie vyměnou velikosti (SEC) je standardem pro sledování těchto kritických parametrů kvality během vývoje i výroby léčiv. Využití jednotného „platformního“ SEC postupu šetří čas i prostředky při validaci, školení personálu a zásobování laboratoře.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo porovnat provozní rozsah a univerzálnost dvou SEC kolon: nové XBridge Premier Protein SEC (250 Å, 2.5 µm) a předchozí generace BioResolve SEC mAb (200 Å, 2.5 µm). Hodnoceny byly separace čtyř biosimilárních mAb (bevacizumab, infliximab, rituximab, trastuzumab) při 20 mM fosfátovém pufru o pH 5.8–7.6 a koncentracích NaCl 50–400 mM v rámci QbD experimentálního plánu.

Použitá metodika a instrumentace

V experimentu bylo generováno 16 mobilních fází kombinací pH (5.8, 6.4, 7.0, 7.6) a NaCl (50, 100, 200, 400 mM) pomocí Empower 3 s Auto•Blend Plus.

• LC systém: ACQUITY UPLC H-Class Bio s CH-30A APH Column Heater
• Detekce: ACQUITY UPLC TUV detektor (280 a 214 nm)
• Software: Empower 3 (FR 4) s Auto•Blend Plus
• Kolony: XBridge Premier Protein SEC 250 Å, 2.5 µm, 7.8×300 mm; BioResolve SEC mAb 200 Å, 2.5 µm, 7.8×300 mm
• Podmínky: teplota kolony 25 °C, vzorku 6 °C, průtok 0.75 mL/min, injekční objem 2–4 µL

Hlavní výsledky a diskuse

Heatmapové vyhodnocení ukázalo, že XBridge Premier SEC nabízí širší provozní rozsah zejména při nižším pH a nižší iontové síle, kdy BioResolve SEC selhávala při kvantifikaci HMW a LMW variant. Při vyšším pH a vyšší koncentraci NaCl byly výsledky obou kolon srovnatelné. XBridge Premier prokázala nižší nespecifické interakce s bílkovinami, stabilní retence a lepší robustnost metody. U bevacizumabu se na XBridge Premier při 400 mM NaCl mírně snížilo rozlišení fragmentu LMW1 (P/V < 1,05), což bylo při ostatních podmínkách konzistentní.

Přínosy a praktické využití metody

Platformní SEC metoda na kolóně XBridge Premier:

• umožňuje analýzu mAb v různých formulacích (mírně kyselé až fyziologické pH, variabilní iontová síla),
• zkracuje dobu vývoje metod a zjednodušuje validaci,
• je kompatibilní s HPLC, UHPLC i UPLC systémy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• rozšíření aplikace na další biologické makromolekuly a genové terapie,
• integrace s on-line charakterizací pomocí hmotnostní spektrometrie,
• vývoj ještě univerzálnějších sorbentů s širším pH rozsahem a sníženými nespecifickými interakcemi,
• zvýšení throughputu nasazením menších částic (1.7 µm) na nízkoodpudových systémech.

Závěr

Nová kolona XBridge Premier Protein SEC prokázala vyšší univerzálnost a stabilitu v širokém rozsahu pH (5.8–7.6) a iontové síly (50–400 mM NaCl) než předchozí BioResolve SEC mAb. Díky nižším nespecifickým interakcím a kompatibilitě s různými chromatografy je vhodná jako platformní metoda pro analýzu monoklonálních protilátek i dalších proteinových terapeutik.

Reference

1. Wang X, An Z, Luo W, Xia N, Zhao Q. Molecular and Functional Analysis of Monoclonal Antibodies in Support of Biologics Development. Protein Cell. 2018;9(1):74–85.
2. Moore R. Leveraging Platform Analytical Methods for Biopharma QbD. Pharma Manufacturing. 2017.
3. Koza SM, Yang H, Yu YQ. Modern Size-Exclusion Chromatography Separations of Biosimilar Antibodies at Physiological pH and Ionic Strength. Waters Application Note 720007484EN. 2022.
4. Yang R, Tang Y, Zhang B, Lu X, Liu A, Zhang YT. High Resolution Separation of Recombinant Monoclonal Antibodies by SE-UHPLC. J Pharm Biomed Anal. 2015;109:52–61.
5. Koza SM, Reed C, Chen W. Impact of LC System Dispersion on the Size-Exclusion Chromatography Analysis of Monoclonal IgG Aggregates and Fragments: Selecting the Optimal Column Configuration for Your Method. Waters Application Note 720006336EN. 2019.
6. Iraneta PC, Koza SM. High Resolution Size-Exclusion Chromatography Separations of Mab Aggregates, Monomers, and Fragments Using BioResolve SEC mAb Columns on UPLC, UHPLC, and HPLC Systems. Waters Application Note 720006956EN. 2020.