Waters ACQUITY and XBridge Premier Protein SEC 250 Å Columns: A New Benchmark in Inert SEC Column Design

Význam tématu

Proteinová velikostně vylučovací chromatografie (SEC) je klíčovou metodou pro charakterizaci bioterapeutik, jako jsou monoklonální protilátky (mAbs) a konjugáty protilátka-lék (ADC). Důležitou výzvou v SEC je potlačení nežádoucích sekundárních interakcí mezi proteiny a povrchy kolony či výplně, které narušují rozlišení a kvantifikaci agregátů, monomerů a fragmentů.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje vývoj a testování nových analytických kolon Waters ACQUITY a XBridge Premier Protein SEC 250 Å, navržených pro dosažení vynikající inertnosti. Cílem bylo ověřit, že kombinace hydroxy-terminalní PEO-vazby na BEH částicích a nové hydrofilní HPS (High Performance Surfaces) konstrukce kolony minimalizuje sekundární interakce a umožňuje práci v nízké iontové síle a bez organických přísad.

Použitá metodika a instrumentace

• LC systém: ACQUITY UPLC H-Class Bio
• Detektor: ACQUITY TUV s titanovou průtokovou kyvetou, 5 mm
• Software: Empower 3
• Kolony porovnání: XBridge Premier Protein SEC 250 Å 2,5 µm, BioResolve SEC mAb 200 Å 2,5 µm, komerční diol a MeO-PEO sloučeniny
• Mobilní fáze: 100 mmol/l fosfátový pufr pH 6,8 s postupným přídavkem NaCl (0–200 mmol/l) pro testy iontových interakcí a organického modifieru (0–15 % MeCN nebo IPA) pro testy hydrofobních interakcí
• Podmínky: teplota kolony 30 °C, vzorek při 8 °C, průtok 0,35 ml/min, objem injekce 1 μl

Hlavní výsledky a diskuse

• Iontové interakce: XBridge Premier s HPS hardware prokázala minimální změnu tvaru špiček a téměř 100% návrat agregátů (HMWS) při NiCl od 0 do 200 mmol/l, kdežto diolové a MeO-PEO kolony vyžadovaly až 200 mmol/l NaCl pro rozumné výsledky.
• Hydrofobní interakce: nová PEO-vazba se ukázala vysoce hydrofilní, monomerní špičky ADC byly vysoce efektivní i bez organického modifieru; přidání 5 % IPA dále zlepšilo ostrost a účinnost špiček.
• Reprodukovatelnost: test na sedmi samostatných šaržích ukázal %RSD menší než 5 % pro stopu monomeru a méně než 20 % pro změnu %HMWS v rozsahu NaCl i organických modifierů.

Přínosy a praktické využití metody

• Přesná a spolehlivá kvantifikace proteinových variant v rozmezí 10–650 kDa bez potřeby vysokých koncentrací soli či organických látek.
• Kompatibilita s jednoduchými fyziologickými pufry (např. PBS) a možnost „plug-and-play“ nasazení do stávajících metod.
• Snížení času věnovaného metodickému vývoji a zvýšení robustnosti QC a výzkumných analýz.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace povrchových chemických úprav kolony pro nové třídy bioterapeutik, včetně bispecifických mAbs a konjugátů.
• Integrace s hmotnostní spektrometrií a on-line multidetektory pro komplexní charakterizaci CQA.
• Automatizace metodických úprav a využití umělé inteligence pro predikci optimálních podmínek separace.
• Vývoj mobilních fází s minimalizovanou organikou pro zajištění stability citlivých proteinů.

Závěr

Kombinace hydroxy-terminálních PEO částic a hydrofilního HPS hardware představuje komplexní řešení pro potlačení sekundárních interakcí v proteinové SEC. Nové kolony ACQUITY a XBridge Premier Protein SEC 250 Å umožňují spolehlivou analýzu agregátů, monomerů a fragmentů v rozsahu biologických pufrů bez nutnosti vysoké chemické modifikace mobilní fáze.

Reference

1. Van der Kant R. et al. Prediction and Reduction of the Aggregation of Monoclonal Antibodies. J Mol Biol. 2017;429(8):1244–1261.
2. Glover ZK. et al. Metal Ion Interactions with mAbs: Part 1. MAbs. 2015;7(5):901–911.
3. Roberts CJ. Therapeutic Protein Aggregation: Mechanisms, Design, and Control. Trends Biotechnol. 2014;32(7):372–380.
4. Goyon A. et al. Evaluation of Size Exclusion Chromatography Columns Packed With Sub-3μM Particles. J Chromatogr A. 2017;1498:80–89.
5. Goyon A. et al. Determination of Isoelectric Points and Relative Charge Variants of 23 Therapeutic mAbs. J Chromatogr B. 2017;1065–1066:119–128.
6. Fekete S. et al. Theory and Practice of Size Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Aggregates. J Pharm Biomed Anal. 2014;101:161–173.