Modern Size-Exclusion Chromatography Separations of Biosimilar Antibodies at Physiological pH and Ionic Strength

Význam tématu

Analytika velikostních variant terapeutických protilátek je klíčová pro hodnocení jejich kvality a stability.
Agregace a fragmentace ovlivňují bezpečnost a účinnost léčiv a vyžadují ne-denaturující podmínky pro věrné zachycení stavu vzorku.
Použití elučního pufru odpovídajícího fyziologickému pH 7.4 a iontové síle 150 mM přibližuje analytická data reálným podmínkám in vivo.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit schopnost moderních SEC kolonek pro biosimilární monoklonální protilátky (mAbs) při použití Dulbecco PBS jako mobilní fáze.
Testovány byly čtyři komerčně dostupné biosimilární mAbs a porovnány čtyři typy sloupců: Waters XBridge Premier, ACQUITY Premier, BioResolve SEC mAb a Cytiva Superdex 200 Increase.
Hodnotila se obnova a rozlišení vysokomolekulárních (HMWS) a nízkomolekulárních (LMWS) frakcí při různých koncentracích PBS.

Použitá metodika a instrumentace

• LC systém Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio s APH ohřevem kolonek
• Detektor UV (214 nm a 280 nm) s titanovou flow buňkou
• Kolonky: XBridge Premier Protein SEC 250 Å 2.5 µm, ACQUITY Premier SEC 250 Å 1.7 µm, BioResolve SEC mAb 200 Å 2.5 µm, Superdex 200 Increase 10/300 GL
• Mobilní fáze: Dulbecco PBS (DPBS) sterilně filtrovaný v koncentracích od 0.8× do 2×
• Průtok 0.25–0.5 ml/min, injekční objem 2–10 µl, teplota vzorku 6 °C
• Správa dat pomocí Empower 3

Hlavní výsledky a diskuse

Na XBridge Premier i BioResolve kolonkách se pro bevacizumab a infliximab ukázala stabilní obnova frakcí při 0.8× až 2× DPBS.
U rituximabu a trastuzumabu byl na BioResolve pozorován pokles HMWS při nižší koncentraci DPBS, který zlepšil přechodný nárůst iontové síly.
XBridge Premier technologie MaxPeak HPS a BEH-PEO zamezila nespecifickým interakcím a poskytla širší rozsah použitelných podmínek.
Porovnání se Superdex 200 Increase ukázalo obdobné kvantitativní výsledky při výrazně kratším čase analýzy díky menším částicím a vyššímu lineárnímu průtoku.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost analýzy mAb za fyziologických podmínek, čímž se minimalizuje arteficiální disociace agregátů
• Zjednodušené nastavení a rychlejší vývoj metod díky komerčnímu PBS pufru
• Vyšší propustnost vzorků oproti tradičním dextranovým kolonkám
• Univerzální platformní přístup pro různé terapeutické proteiny o hmotnosti od 10 kDa do 650 kDa

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj inertních povrchových úprav částic pro minimalizaci nespecifických vazeb a rozšíření pH rozsahu.
Optimalizace pufrových systémů pro glykosylované, konjugované nebo jinak modifikované proteiny.
Integrace se světelně rozptylovými a dalším detekčními technikami pro pokročilou charakterizaci agregátů v reálném čase.

Závěr

Moderní SEC kolony XBridge a ACQUITY Premier umožňují spolehlivou kvantifikaci velikostních variant biosimilárních mAbs v mobilní fázi odpovídající fyziologickému prostředí.
V porovnání s dextranovými kolonkami kombinují vysokou propustnost, univerzálnost metod a věrné zachycení stavu analyzovaných proteinů.

Reference

1. Arakawa T, Ejima D, Li T, Philo JS. The critical role of mobile phase composition in size exclusion chromatography of protein pharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2010;99(4):1674–1692.
2. Goyon A, Excoffier M, Janin-Bussat MC, et al. Determination of isoelectric points and relative charge variants of 23 therapeutic monoclonal antibodies. Journal of Chromatography B. 2017;1065–1066:119–128.
3. Wen J, Arakawa T, Philo JS. Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions. Analytical Biochemistry. 1996;240(2):155–166.
4. Koza SM, Reed C, Chen W. Impact of LC system dispersion on the size-exclusion chromatography analysis of monoclonal IgG antibody aggregates and fragments: Selecting the optimal column configuration for your method. Waters Application Note 720006336EN. 2019.