Rapid SEC-UV Analysis of Monoclonal Antibodies Using Ammonium Acetate Mobile Phases

Význam tématu

Ve vývoji a kontrole bioterapeutik představují monoklonální protilátky klíčovou třídu léčiv. Měření jejich agregace a fragmentace je zásadní pro zajištění bezpečnosti a účinnosti, neboť nesprávné shlukování nebo degradace mohou ovlivnit farmakokinetiku, imunogenicitu a stabilitu konečného produktu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo vyvinout a ověřit vysoce průtokovou (HT), 4minutovou metodu velikostně vylučovací chromatografie s UV detekcí (SEC-UV) pro rychlou analýzu agregovaných (HMWS) a fragmentovaných (LMWS) forem mAbs. Důraz byl kladen na použití 200 mM roztoku volitelné soli amonného octanu (AMA), která je kompatibilní s LC-MS systémy, a na robustnost metody během stovek analýz.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda je založena na SEC-UV s následujícími klíčovými parametry:

• Kolona: ACQUITY Premier Protein SEC, 250 Å, 1,7 µm, 4,6×150 mm
• Mobilní fáze: 200 mM amonný octan, pH ~7,0, LC-MS grade, průtok 0,5 mL/min
• Detekce: UV absorbance při 280 nm
• Teploty: kolona 25 °C, vzorky 6 °C
• Objem injekce: obvykle 5 µL, případně menší pro vzorky s vysokým obsahem HMWS

Použitá instrumentace

• ACQUITY™ Premier UPLC s Binary/Quaternary Solvent Manager
• BioAccord™ LC-MS systém (ESI-Tof)
• UV detektor ACQUITY UPLC TUV, 5 mm titaniová kyveta
• Empower™ 3 a UNIFI™ software pro řízení a vyhodnocení dat

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace koncentrace AMA (100–300 mM) pro sedm různých mAb odhalila, že při ≥150 mM je separace agregátů i fragmentů konzistentní. Volba 200 mM AMA zajistila dostatečné rozlišení i pro nejcitlivější vzorky.

Test stability metody při různých koncentracích vzorku (0,5–2,0 mg/mL) pro trastuzumab ukázal stabilní stanovení relativních podílů HMW a LMW forem (RSD ≤3 %). Mícháním dvou přípravků trastuzumabu se potvrdila lineární kvantifikace i pro Nižší úrovně variant (<1 %).

Protein A čištění vzorků z buněčných médií obohacených o trastuzumab-anns potvrdilo, že metoda spolehlivě detekuje velikostní varianty i po automatizované purifikaci, se zachovanou přesností (HMW RSD až 3,5 %, LMW až 2,8 %).

Kolonová životnost vyhodnocená na více než 700 bězích během 3 měsíců potvrdila minimální změnu retencí a akceptovatelné rozlišení i v závěru experimentu.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá 4minutová analýza agregací a fragmentů mAb v procesu vývoje a kontroly kvality.
• Kompatibilita s UPLC-MS systémy díky volitelné, substituční sloučenině AMA.
• Široké uplatnění při monitorování buněčných kultur, průběžné kontrole purifikace a stabilitních studiích.
• Vysoká robustnost a dlouhodobá životnost kolony umožňující vysoký průtok vzorků bez ztráty výkonu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Ve světle rostoucí poptávky po rychlých a spolehlivých metodách se očekává:

• Integrace se systémovou automatizací a on-line monitoringem v bioprocesech.
• Využití citlivějších detektorů (fluorescenční, nízkovlnných UV) pro dosažení nižších LOD/LOQ.
• Další optimalizace mobilních fází s přímou spojitostí na MS detekci a nativní SEC-MS analýzu.
• Širší aplikace na jiné biologické makromolekuly (fúzní proteiny, rekombinantní enzymy).

Závěr

Popsaná SEC-UV metoda s amonným octanem představuje rychlý, robustní a vysoce průtokový nástroj pro monitorování velikostních variant mAb. Díky kompatibilitě s LC-MS platformami a dlouhodobé stabilitě kolony je vhodná pro rutinní nasazení v biotechnologických laboratořích a vývojových centrech.

Reference

1. Moussa EM et al. Immunogenicity of Therapeutic Protein Aggregates. J Pharm Sci. 2016;105(2):417–430.
2. Koza SM et al. Expanding Size-Exclusion Chromatography Platform Method Versatility… Waters Application Note. 2022.
3. Koza SM, Yu YQ. Rapid Size Variant Analysis… Waters Application Note. 2022.
4. Pinhal S et al. Acetate metabolism and the inhibition of bacterial growth by acetate. J Bacteriol. 2019.
5. Koza SM et al. Impact of LC System Dispersion on the Size-Exclusion Chromatography Analysis… Waters Application Note. 2019.
6. Dunn ZD et al. Rapid two-dimensional Protein-A size exclusion chromatography… MAbs. 2020.