HILIC as an Alternative Separation Mode for Intact Mass Confirmation of Oligonucleotides on the BioAccord System

Význam tématu

Oligonukleotidové terapie se stávají významnou skupinou léčivých přípravků, které vyžadují přesné stanovení integrity molekuly a správné molekulové hmotnosti. Intaktní hmotnostní potvrdí identitu a čistotu oligonukleotidů a je klíčová pro vývoj, výrobu a QC v biotechnologickém průmyslu. Hydrofobně interakční chromatografie (HILIC) nabízí alternativní přístup k tradiční iontově párované RP chromatografii, přináší nižší náklady, nižší toxicitu mobile fáze a vyšší stabilitu signálu pro LC–MS analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit schopnost platformy BioAccord LC–MS se systémem waters_connect provádět rychlou a automatizovanou analýzu intaktní hmotnosti malých a středně velkých oligonukleotidů (do 50 nukleotidů) pomocí HILIC separace. Studie porovnávala tradiční RP–IP metodu s HILIC metodou na konvenčním BEH Amide sloupci a na novém Premier BEH Amide sloupci s MaxPeak HPS povrchem, hodnotila přesnost hmotnostního měření, reprodukovatelnost a praktické přínosy pro workflow.

Použitá metodika a instrumentace

Analýzy byly provedeny na BioAccord LC–MS systému, který sestává z:

• ACQUITY UPLC I-Class PLUS
• Tunable UV detektor (TUV)
• ESI-Tof ACQUITY RDa detektor
• Software waters_connect pro akvizici, zpracování a reportování dat

Chromatografické podmínky:

• Kolony: ACQUITY Premier BEH Amide 1,7 μm, 2,1×50 mm (MaxPeak HPS) a standardní BEH Amide Kolona
• Teplota kolony: 60 °C, teplota vzorkovače: 6 °C
• Mobilní fáze A: 10 mM acetát amonný v 75 % acetonitrilu/voda, B: 10 mM acetát amonný v 25 % acetonitrilu/voda
• Gradient: rozběh 90 % A → 60 % A během 6 min, návrat na výchozí podmínky a reequilibrace
• Průtok: 300 μL/min, objem injekce: 1–2 μL

MS podmínky:

• Ionizace ESI- v režimu negativního iontového módu
• Rozprašovací teplota: 120 °C, desolvace: 400 °C, tlak dusíku: 6,5 bar
• Rozsah m/z 400–5000, rychlost akvizice 2 Hz
• Zpracování: BayesSpray dekonvoluce v waters_connect

Hlavní výsledky a diskuse

1) Na standardním BEH Amide sloupci s kovovým hardware byla nutná pasivace sloupce až po šest injekcích vysoce koncentrovaného OST standardu, přičemž velké oligonukleotidy vykazovaly nízké zotavení. Premier BEH Amide sloupec s HPS technologií poskytl stejnoměrné chromatografické odezvy již od první injekce a odhalil až 20 nízkohmotnostních nečistot bez pasivace.

2) ESI-MS spektra z HILIC separace ukázala pouze tři dominantní nabité stavy pro OST komponenty a čtyři u 25-mer a 57-mer oligonukleotidů, což indikuje zachování nativní konformace. IP-RP metoda vedla k bimodálnímu rozložení nabitých stavů (7–15 stavů) kvůli denaturaci a iontovému párování.

3) BayesSpray dekonvoluce HILIC dat dosáhla přesnosti hmotnosti lepší než 15 ppm pro všechny testované oligonukleotidy (např. -4,0 ppm pro 25-mer PS, -10,2 ppm pro 57-mer).

4) Stabilita mobilní fáze HILIC: mobilní fáze připravené v objemu 1 L zachovaly konstantní MS/UV poměr odezvy dT15 po dobu až 14 dnů, což významně překonává běžnou životnost IP-RP mobilní fáze (~1 den).

Přínosy a praktické využití metody

• Snížení nákladů na mobilní fáze až o 90 % díky vynechání drahých a toxických iontových modifierů (např. HFIP)
• Nižší toxicita a bezpečnější provoz laboratoře bez potřeby manipulace s fluoroalkoholy
• Delší stabilita mobilní fáze (až 2 týdny) bez ztráty MS signálu
• Zkrácení času přípravy a údržby sloupce díky eliminaci pasivace na Premier sloupci s HPS
• Vysoce přesné a reprodukovatelné měření intaktní hmotnosti pro QC a vývoj oligonukleotidových léků

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj HILIC metodiky pro oligonukleotidy může zahrnovat:

• Automatizovanou sekvenční analýzu a detekci modifikací
• Integraci s dalšími technikami (IM-MS, HDX-MS) pro studium konformace
• Vývoj specializovaných stacionárních fází optimalizovaných pro RNA, DNA a konjugáty
• Rozšíření do klinické farmakokinetiky, toxikologie a stability léčiv

Závěr

HILIC jako separační režim na BioAccord LC–MS systému nabízí životaschopnou alternativu k RP–IP metodám pro intaktní hmotnostní potvrzení oligonukleotidů. Metoda poskytuje vysokou přesnost, reprodukovatelnost, nižší provozní náklady a delší stabilitu provozu, a to při zachování jednoduchosti automatizovaného, compliance-ready workflow.

Reference

1. Sharma VK, Watts JK. Future Med Chem. 2015;7(16):2221–2242.
2. Roberts TK, Langer R, Wood MJA. Nat Rev Drug Discov. 2020;19:673–694.
3. Doneanu CE et al. Waters App Note 720006820EN. 2020.
4. Doneanu CE et al. Waters App Note 720007028EN. 2020.
5. Goyon A et al. J Pharm Biomed Anal. 2020;182:1–17.
6. Sutton JM et al. J Am Soc Mass Spectrom. 2020;31:1775–1882.
7. Lobue PA et al. J Chromatogr A. 2019;1595:39–48.
8. Lauber M et al. Waters White Paper 720006930EN. 2020.
9. DeLano M et al. Anal Chem. 2021;93:5773–5781.
10. Gilar M et al. J Chromatogr A. 2021;1650:462247.
11. Brennan K et al. Waters App Note 720007119EN. 2021.
12. Koshel BM et al. Waters App Note 720007238EN. 2021.
13. Alpert AJ. J Chromatogr. 1990;499:176–196.
14. Hemstrom P, Irgum K. J Sep Sci. 2006;29:1784–1821.
15. Gilar M et al. Nucleic Acids Res. 1997;25:3615–3620.
16. Zhang R et al. Biochem Pharmacol. 1995;49:929–939.
17. Birdsall R et al. Rapid Commun Mass Spectrom. 2016;30:1667–1679.