LC-MS Analysis of siRNA, Single Guide RNA and Impurities Using the BioAccord™ System with ACQUITY™ Premier and New Automated INTACT Mass Application

Význam tématu

Oligonukleotidové terapie, včetně siRNA pro gene silencing a sgRNA pro CRISPR/Cas9 editaci, vyžadují spolehlivou kontrolu čistoty a potvrzení molekulární hmotnosti. LC-MS metody poskytují citlivou a selektivní analýzu těchto dlouhých a chemicky modifikovaných molekul.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem application note je představit plně automatizovaný a compliance-ready LC-MS workflow založený na systému BioAccord s ACQUITY Premier a waters_connect INTACT Mass aplikací. Studie demonstruje analýzu krátkých 20-mer siRNA a delších 100-mer sgRNA oligonukleotidů včetně jejich nízkoúrovňových nečistot.

Použitá metodika a instrumentace

Pro chromatografii byl použit ACQUITY Premier UPLC s Premier CSH C18 kolonkou (2,1×100 mm, 1,7 µm, 130 Å) při 50 °C a průtoku 300 µL/min v IP-RP režimu s mobilními fázemi HFIP/DIPEA ve vodě a acetonitrilu. MS detekce probíhala na ESI-Tof detektoru (RDa) v módu negativní ionizace, rozsah m/z 400–5000, masová přesnost lépe než 20 ppm. Data zpracovává waters_connect INTACT Mass aplikace s automatickou detekcí píků, dekonvolucí (MaxEnt1, BayesSpray) a přiřazením modifikací.

Hlavní výsledky a diskuse

• Pro 21-mer siRNA separace na BioAccord systému umožnila detekci 11 nečistot, včetně posloupnostních zkratek a izomerů, s masovou přesností pod 15 ppm a citlivostí až 0,2 % dle UV.
• Pro 100-mer sgRNA byla optimalizována separace na CSH koloně. Identifikovány čtyři hlavní nečistoty (PS→PO desulfurizace, +53 Da CNET, +70 Da IBT, +80 Da extra fosfát) s citlivostí přibližně 1 % dle ESI-MS a masovou přesností <20 ppm.
• Konvenční UV separace je u dlouhých oligonukleotidů nedostatečná pro plné rozlišení; ESI-MS počty iontů poskytují spolehlivou kvantifikaci nečistot.

Přínosy a praktické využití metody

• Plně automatizované workflow splňuje požadavky regulace a zkracuje dobu analýzy.
• Mass accuracy ~20 ppm zaručuje spolehlivé potvrzení identit dlouhých oligonukleotidů.
• Citlivost pro nečistoty do 0,2 % (krátké) a ~1 % (dlouhé) umožňuje sledovat nízkoúrovňové defekty.
• Metoda je vhodná pro rutinní QC syntetických terapeutických oligonukleotidů a sgRNA pro gene editing.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšiřování knihovny modifikací v INTACT Mass pro detekci nových degradačních produktů.
• Vývoj speciálních kolon a optimalizace gradientů pro lepší rozlišení dlouhých molekul.
• Integrace s LIMS a plná digitalizace reportingu v regulovaných prostředích.
• Studie mechanizmů degradace a in-source artifactů pro zvýšení spolehlivosti dat.

Závěr

BioAccord systém s ACQUITY Premier a waters_connect INTACT Mass aplikací představuje účinné řešení pro automatizovanou LC-MS analýzu intact mass a čistoty oligonukleotidových terapeutik. Metoda poskytuje vysokou přesnost hmotnostního měření a citlivé stanovení nečistot, což je klíčové pro vývoj a kontrolu kvality siRNA a sgRNA molekul.

Reference

• 1. Sharma VK, Watts JK; Oligonucleotide Therapeutics: Chemistry, Delivery, and Clinical Progress; Future Med Chem; 2015;7(16):2221–2242.
• 2. Roberts TK, Langer R, Wood MJA; Advances in Oligonucleotide Drug Delivery; Nat Rev Drug Discov; 2020;19:673–694.
• 3. Obika S, Sekine M (eds.); Synthesis of Therapeutic Oligonucleotides; Springer; 2018.
• 4. Sutton JM et al.; Current State of Oligonucleotide Characterization Using LC-MS; J Am Soc Mass Spectrom; 2020;31:1775–1782.
• 5. Pourshahian S; Therapeutic Oligonucleotides, Impurities and Degradants; Mass Spectrom Rev; 2019;00:1–35.
• 6. Doneanu C.E. et al.; An Automated Compliance-Ready LC-MS Workflow for Intact Mass Confirmation and Purity Analysis of Oligonucleotides; Waters App Note; 2020;720006820.
• 7. Doneanu C.E. et al.; Intact Mass Confirmation Analysis on the BioAccord LC-MS System; Waters App Note; 2020;720007028.
• 8. Doneanu C.E. et al.; Analysis of Oligonucleotide Impurities on the BioAccord System with ACQUITY Premier; Waters App Note; 2021;720007301.
• 9. Wei B. et al.; Development of IP-RP LC-MS Method for CRISPR Guide RNAs; J Chrom A; 2022;1665:462839.
• 10. Reese CB, Yan H; Desulfurization of Oligonucleotide Phosphorothioates; Tetrahedron Lett; 2003;44:2501–2509.
• 11. Krotz AH et al.; Peroxide-Mediated Desulfurization of PS Oligonucleotides; J Pharm Sci; 2005;94:341–348.
• 12. Wu L. et al.; PS Desulfurization via Hydroxyl Radical in ESI-MS; J Mass Spectrom; 2012;47:836–844.
• 13. Nikcevic I. et al.; Detecting Low-Level Impurities in PS Oligonucleotides; Int J Mass Spectrom; 2011;304:98–104.
• 14. Fountain K, Gilar M, Gebler JC; Analysis of Modified Oligonucleotides by IP-RP HPLC/ESI-MS; Rapid Commun Mass Spectrom; 2003;17:646–653.
• 15. Capaldi D. et al.; Impurities in Oligonucleotide Drug Substances and Products; Nucleic Acid Ther; 2017;27:309–322.
• 16. Rousis SG, Cedillo I, Rentel C; Automated Determination of Early Eluting Impurities; Anal Biochem; 2020;595:113623.
• 17. Shion H. et al.; INTACT Mass – waters_connect App for Biotherapeutics; Waters App Note; 2022;720007547.
• 18. Ferrige AG. et al.; Disentangling Electrospray Spectra With Maximum Entropy; Rapid Commun Mass Spectrom; 1992;6:707–711.
• 19. Rodriguez AA. et al.; Formation of N2-acetyl-2,6-diaminopurine Impurity; Bioorg Med Chem Lett; 2014;24:3243–3246.
• 20. Smith M, Beck T; Quantitation of Low-Level Coeluting Impurity in Oligonucleotide; J Pharm Biomed Anal; 2016;118:34–40.